Mozaïek Analyse van Gene Functie in Postnatale Mouse ontwikkeling van de hersenen met behulp van Virus-based Cre recombinatie

Samenvatting

Een In vivo Methode om gen-functie te testen in postnatale hersenen wordt beschreven. Recombinant AAVs uiten Cre-en / of een fluorescerend eiwit wordt geïnjecteerd in neonatale hersenen van muizen. Mozaïek gen inactivatie en schaars neuronale etikettering worden bereikt, waardoor een snelle analyse van de genfunctie in processen van cruciaal belang voor neurale circuit ontwikkeling.

Samenvatting

Een normale hersenfunctie vertrouwt niet alleen op de embryonale ontwikkeling als de belangrijkste neuronale paden zijn gevestigd, maar ook op de postnatale ontwikkeling bij het neurale circuits zijn gerijpt en verfijnd. Misregulation in dit stadium kan leiden tot neurologische en psychiatrische aandoeningen zoals autisme en schizofrenie ^1,2. Veel genen zijn onderzocht in de prenatale hersenen en vond cruciaal belang voor vele ontwikkelingsprocessen ^3-5. Echter, hun functie in de postnatale hersenen is grotendeels onbekend, mede omdat hun verwijdering in muizen leidt vaak tot sterfte tijdens de neonatale ontwikkeling, en deels omdat hun eis in de vroege ontwikkeling belemmert de postnatale analyse. Om deze obstakels, worden floxed allelen van deze genen op dit moment geproduceerd in muizen ^6. In combinatie met transgene allelen die uitdrukken Cre recombinase in specifieke celtypen, voorwaardelijke verwijdering kan worden bereikt om gen-functie in de postnatale hersenen te bestuderen. Echter, deze methode vereist bijkomende allelen en extra tijd (3-6 maanden) voor het genereren van de muizen met de juiste genotypen, waardoor het beperken van de uitbreiding van de genetische analyse van een grote schaal in de hersenen van muizen.

Hier laten we zien een complementaire aanpak die viraal geuit Cre gebruikt om deze floxed allelen bestuderen snel en systematisch in postnatale ontwikkeling van de hersenen. Door het injecteren van recombinant adeno-geassocieerde virussen (rAAVs) ^7,8 codering Cre in de neonatale hersenen, we zijn in staat om het gen van interesse in de verschillende gebieden van de hersenen te verwijderen. Door het beheersen van de virale titer en coexpressing een fluorescerend eiwit marker, kunnen we tegelijkertijd realiseren mozaïek-gen inactivatie en spaarzame neuronale etikettering. Deze methode omzeilt de eis van vele genen in de vroege ontwikkeling, en stelt ons in staat om te studeren hun cel autonome functie in een groot aantal kritische processen in de postnatale ontwikkeling van de hersenen, waaronder axonale en dendritische groei, vertakkingen, en tegels, maar ook synapsvorming en verfijning. Deze methode is met succes gebruikt in onze eigen lab (niet gepubliceerde resultaten) en anderen ^8,9, en kan worden uitgebreid tot andere virussen, zoals lentivirus ^9, evenals voor de uitdrukking van shRNA of dominante actieve eiwitten ^10. Bovendien, door het combineren van deze techniek met de elektrofysiologie, alsook recent ontwikkelde optische beeldvorming tools ^11, deze methode zorgt voor een nieuwe strategie om te onderzoeken hoe genetische pathways invloed neurale circuit de ontwikkeling en functie in muizen en ratten.

Protocol

1. Voorbereiden virussen voor injectie

1. rAAVs werden gekocht bij de aanbevolen commerciële leverancier, maar ze kunnen ook worden geproduceerd in het eigen lab (zie bespreking hieronder). Het virus oplossing is meestal geproduceerd in een titer van ~ 1x10 ¹² exemplaren van het genoom per milliliter (GC / ml) en kan gebruikt worden op volle titer van een groot aantal van de cellen te manipuleren. Als alternatief kunnen zij worden verdund tot het gewenste niveau van schaars etikettering te produceren. De aangewezen verdunning moet worden bepaald door de gebruiker, maar een 1:10 verdunning wordt aanbevolen te beginnen.
2. Onmiddellijk dooi virussen op ijs voor gebruik. Breng de gewenste pre-verdunningsvolume van het virus oplossing in een kleine (~ 250μl) PCR-buis. Verdun de virus-oplossing met behulp van een geschikt volume van steriele DPBS in een weefselkweek kap. Bewaar verdunde virus oplossing op ijs totdat het nodig is.

LET OP: afhandeling van alle virussen moet worden uitgevoerd in overeenstemming met een protocol inzake bioveiligheid goedgekeurd door uw instelling

2. Spuit laad-en montage van apparatuur

1. Sluit het laden naald om het glas spuit en het opstellen van het virus oplossing uit de PCR-buis door zachtjes te trekken van de zuiger. Trek de zuiger tot een zeer kleine luchtbel kan worden gezien in de spuit, dit geeft aan dat alle van de oplossing in de spuit en is niet meer in het laden naald. Als alternatief kan een kleine hoeveelheid inerte kleurstof toegevoegd worden aan de oplossing om zichtbaar te maken.
   OPMERKING: Een kleine PCR buis moet worden gebruikt als het laden naald is meestal niet lang genoeg om de bodem van de meeste andere buizen te bereiken.
2. Verwijder de laad-naald en leg de spuit op de spuit blok van een spuit pomp, beveiligen met de spuit houder.
3. Steek het ene uiteinde van de verbindende slang in de spuit, plaatst u het andere uiteinde in de naaldhouder. Steek de injectienaald in de naaldhouder. Het einde van de injectienaald moet direct contact opnemen met het einde van de verbindende buis binnenkant van de naaldhouder.
4. Langzaam handmatig de zuiger om de oplossing door te drukken van de verbindende slang. Duwen totdat er een druppeltje van de oplossing is zichtbaar aan de punt van de injectienaald.
5. Voorzichtig de positie van de zuiger naast de duwboot blok en maak het vast met de pusher blok beugel.
6. Stel de injectie parameters: injectiesnelheid moet ongeveer 8μl/min (~ 130nl / s); injectievolume is typisch een-2ul, selecteer de juiste spuit diameter voor de spuit formaat dat u gebruikt (zie de spuit pomp handleiding voor richtlijnen).
7. Zet de kookplaat tot ~ 38 ° C en dek af met een papieren handdoek of een ander dun belemmering voor de pups te beschermen tijdens de herstelfase.

3. Injectie procedure en pup herstel

1. Bereid P0 of P1 muis pups voor injectie door hen te onderwerpen aan koude anesthesie na een IACUC goedgekeurde protocol. Bevochtig een paar papieren handdoekjes met water en leg ze op ijs. Plaats het gewenste aantal pups (4-5) op het papier handdoek (houd ze goed gescheiden) en voorzichtig Vouw het papier handdoeken over de pups, zodat ze gedekt zijn door vochtig papieren doekje. Plaats voorzichtig een kleine hoeveelheid ijs op de top van de papieren handdoeken en incubeer de pups gedurende ongeveer 5 minuten. De pups kunnen worden bewaard op ijs tot maximaal 15 minuten en daarna terug te fijn.
2. Nadat de pup voldoende verdoofd, plaats het op een montage blok (we gebruiken een piepschuim blok dat normaal gesproken bevat 15 ml buizen) en plaats deze voor de beste toegang tot de plaats van injectie. Voor de cortex is het makkelijkst om het dier plat op haar buik, terwijl het voor de kleine hersenen is het zinvol om de pup de positie van het hoofd over de rand van het blok een betere toegang tot de achterkant van de schedel te bieden. De pup kan worden vastgezet met een band-steun, indien gewenst.
3. Houd de pup het hoofd op zijn plaats met een hand terwijl de naald handmatig wordt ingebracht via de schedel op de gewenste plaats met de andere hand. Het is nuttig om trek de huid strak om te voorkomen dat bewegen tijdens injectie. Voor de cortex is het nuttig om de injecties ten opzichte van een welbepaalde anatomische oriëntatiepunt, zoals de lambda hechting van de schedel te maken, omdat dit zal helpen in de toekomst injecties. Het cerebellum kan worden gezien door de schedel als een dunne strook van weefsel liggen direct caudaal van de colliculus. De diepte waarop de naald moet worden ingevoegd verschilt enigszins tussen individuele dieren en stammen en kan worden gemeten door vooraf bepaalde markers op de naald, maar voor de cortex en het cerebellum zien we dat een diepte van ~ 0,5 - 1 mm van het oppervlak is meestal geschikt. De insteekdiepte voor andere sites moet experimenteel worden bepaald door de eindgebruiker.
   LET OP: De naald moet gemakkelijk binnendringen in de schedel, zo niet, NIET te hard, want dit kan het dier verwonden. Plaats de naald en voorzichtig opnieuw te proberen.
4. Injecteer het virus oplossing. De injectie is te startened door op de START knop op de pomp of deprimerende een voetpedaal, afhankelijk van het model van de druk injector gebruikt. Bij het ontbreken van een voetpedaal is het raadzaam om een ​​collega te helpen bij druk op de knop om onnodige handbewegingen dat de injectie van invloed kunnen minimaliseren.
5. Na de geselecteerde volume is geïnjecteerd, houd de naald op zijn plaats voor een paar seconden en dan voorzichtig de naald te verwijderen door te schuiven soepel verloopt. Zorg ervoor dat de pup het hoofd van zijn plaats te houden om vreemde bewegingen te minimaliseren. Omdat de injectie-apparatuur wordt gereinigd en gesteriliseerd tussen de experimenten met ethanol en de wond is klein, het gebruik van antiseptische is overbodig.
6. Leg de pup op het overdekte kookplaat met de temperatuur ingesteld op ~ 38 ° C te warm-up voor herstel, gewoonlijk 5-10 minuten. Gedurende deze tijd kunt u blijven injecteren andere pups.
7. Nadat alle pups hebben zich hersteld (ze moeten roze en bewegen) nemen een deel van het huis beddengoed en voorzichtig de pups wrijf ermee. Zet de pups aan de moeder als een groep.

LET OP: Het is zeer belangrijk om ervoor te zorgen dat de pups zijn voorafgaande warm en blootgesteld aan huis beddengoed om terug te bezorgen aan de moeder en ze terug te keren als een groep. Doet u dit niet kan resulteren in de moeder, verwonden of doden van de pups.

4. Apparatuur schoonmaken

1. Na de injectie is voltooid en de pups zijn teruggekeerd naar hun moeder, schoon de injectie setup door volledig laden van de spuit met aceton of 70% ethanol. Spoel de oplossing door de injectie setup meerdere malen, met verse oplossing per keer. Dit verwijdert alle resterende virus oplossing en neerslaat. De aceton of ethanol zal dan verdampen.
   LET OP: Aceton is bij voorkeur voor het schoonmaken, maar als je setup gebruik maakt van een aceton-gevoelige componenten, zoals cyanoacrylaat lijmen, dan is 70% ethanol te gebruiken voor deze stappen.
2. Ontsmet het werkgebied met bleekmiddel en gooi afval in een geschikte biohazard container.

5. Analyse

1. Offeren de dieren op de gewenste leeftijd met behulp van een IACUC goedgekeurd euthanasie methode. Perfusie fixatie wordt aanbevolen om te helpen bij latere visualisatie van geïnfecteerde neuronen, met name in volwassen dieren.
2. Standaard immunokleuring procedures kunnen worden gebruikt om het fluorescerende signaal te versterken. Kortom, zijn 100 micrometer drijvende vibratome secties gepermeabiliseerd met PBS +1% Triton X-100 en geblokkeerd in PBS +1% Triton X-100 +10% normaal geit serum. Secties worden geïncubeerd in het blokkeren van oplossing met primaire antilichamen overnacht bij 4 ° C, gevolgd door extra wassen en te blokkeren. Secties worden dan geïncubeerd in het blokkeren van oplossing met secundaire antilichamen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, grondig gewassen, gemonteerd op dia's en afgedekt met anti-fade montage media. Vriescoupes kunnen ook worden gebruikt om het label neuronen zichtbaar te maken, maar de endogene fluorescentie kunnen verloren gaan.

6. Representatieve resultaten:

Een succesvolle injectie procedure zal produceren robuuste infectie van neuronen in de regio van de injectieplaats met geen waarneembare weefselschade of andere nadelige effecten op het dier. Zoals geïllustreerd in figuur 1, kan de verspreiding van de infectie worden waargenomen bij Cre-reporter muizen (ROSA26R) ¹² geïnjecteerd met rAAV8-Cre in verschillende anatomische sites. Injecties in specifieke regio's, zoals de cortex en een superieure colliculus, typisch het genereren van lokale infecties met minimale verspreiden naar aangrenzende regio's (Fig. 1A-B). Gebruik van hoge titer virus oplossing maakt infectie van aangrenzende gebieden, zoals de hippocampus, een grotere kans (Fig. 1A). Injectie met een lage titer virus oplossing resulteert in een schaars infectie, die meestal blijft de buurt van de plaats van injectie, zoals aangegeven in de cerebellaire injectie van rAAV8-Cre op de middellijn van ROSA26R reporter muizen (figuur 1C-D). We hebben gezien recombinatie in ROSA26R reporter muizen binnen 2 dagen na de injectie van rAAV8-Cre, wat suggereert dat infectie, recombinatie, en expressie van genen reporter allemaal kunnen komen relatief snel. Daarnaast hebben we met succes hebben deze techniek gebruikt om de effecten van de gendeletie studie aan een niet-ROSA locus met behulp van een floxed voorwaardelijke allel, zullen de resultaten van die elders worden gepubliceerd.

Het aantal geïnfecteerde cellen zou moeten correleren met de titer van de geïnjecteerde virale oplossing. Bijvoorbeeld, het injecteren van een mix van hoge titer oplossingen van twee rAAV8 virussen die verschillende fluorescerende eiwitten in de kleine hersenen infecteert vele Purkinje cellen die differentieel zijn gelabeld (Fig. 2A). Omgekeerd kan het injecteren van een lage titer virus-oplossing leidt tot spaarzame infectie te helpen bij het visualiseren van enkele cellen (Fig. 2B). Fluorescent gelabelde neuronen kan direct worden waargenomen in vers gesneden, levend weefsel (Fig. 2B) of kan worden onderworpen aan immunokleuring aan de endogene fluorescerende signalen voor latere beeldacquisitie versterken door wide-field of confocal fluorescentie microscopie (Fig. 2A, Fig. 3A-C). Ten slotte rAAV8 in staat is om te infecteren een verscheidenheid aan types neuron in de cortex met sterke kenmerken van fijne processen (Fig. 3A-C).

Figuur 1: LacZ kleuring in de hersenen van ROSA26R reporter muizen die waren met rAAV8-Cre geïnjecteerd op P0 toont Cre-activiteit en de locatie van de infectie.

1. Wide-field sagittale het oog op een P14 hersenen met een hoge titer (1x10 ¹² GC / ml) injecties in de cortex en superieure colliculus. Het gebruik van hoge titer virus maakt het waarschijnlijker dat de aangrenzende gebieden zal ook worden besmet.
2. Sagittale doorsnede van de P14 cortex geïnjecteerd met een lagere titer (1x10 ¹¹ GC / ml) virus vertoont een lokale infectie met minder verspreiden.
3. Een wholemount uitzicht op een P28 cerebellum geïnjecteerd op de middenlijn met een lage titer (1x10 ⁹ GC / ml)-virus-oplossing laat zien dat de infectie schaars is en meestal blijft de buurt van de plaats van injectie.
4. Sagittale uitzicht op de middellijn van het cerebellum in C). Merk op dat over het algemeen alleen Purkinje cellen zijn geïnfecteerd door rAAV8.

Figuur 2: Cerebellaire labeling door injectie met een hoge en lage titers van rAAV8 uiten van fluorescerende eiwitten.

1. Een sagittale doorsnede van P21cerebellum besmet zijn met een mix van twee virussen te drukken EGFP (groen) en DsRed (rood). Een hoge titer mix van virussen werd gebruikt om een ​​groot aantal van Purkinje cellen te infecteren.
2. Een Purkinje cel in levende P14 cerebellum van zeer lage titer virale infectie afgebeeld onmiddellijk na dissectie.

Figuur 3: Corticale etikettering door rAAV8-DsRed.
Voorbeelden van de verscheidenheid van de corticale neuron types in het coronale delen van een P21 cortex die werd besmet door rAAV8-DsRed bij P0.

Discussie

De neonatale virale injectiemethode hier wordt gepresenteerd biedt een eenvoudige en snelle manier voor het genereren van in vivo mozaïeken voor de studie van postnatale ontwikkeling van de hersenen. De methode maakt gebruik van floxed allelen die momenteel beschikbaar zijn en als die worden gedaan via de High Throughput Gene Targeting project ^6. In vergelijking met het gebruik van transgene expressie van Cre, deze methode biedt een snelle manier om genfunctie in verschillende celtypen te testen, als...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogus nummer	Commentaar (optioneel)
rAAV8-Cre,-GFP,-DsRed,	Vector Biolabs	# 7060, # 7061, custom order	http://www.vectorbiolabs.com
Harvard Pomp 11 Plus	Harvard Apparatuur	# 702208	(Geen voetpedaal-poort)
Retinale pigmentepitheel Injection Kit	Wereld precisie-instrumenten	RPE-KIT	Bevat verbindende slang, injectienaalden (36g), en naaldhouder
NanoFil Spuit, 100μl	Wereld precisie-instrumenten	NANOFIL-100	Inclusief herbruikbare het laden van de naald
D-PBS	Invitrogen	14040-117
GFP antilichaam	Aves	GFP-1020
DsRed antilichaam	Clontech	632496
Verwarming Block	VWR	97042-610
ROSA26R muis	Jackson Laboratory	003309