Aviaire Influenza Surveillance met FTA Kaarten: Field Methods, bioveiligheid, en transport problemen opgelost

Samenvatting

Een methode om te bewaren, op te sporen en de volgorde RNA virussen van aviaire influenza werd gevalideerd en uitgebreid met behulp van natuurlijke fecesmonsters van vogels. Deze techniek verwijdert de noodzaak van het handhaven van een koelketen en behandeling van besmettelijke virussen en kan worden toegepast in een 96-wells high-throughput setup.

Samenvatting

Aviaire Influenza virussen (AIVs) infecteren veel zoogdieren, inclusief de mens ^1. Deze AIVs zijn divers in hun natuurlijke gastheren, onderdak bieden aan bijna alle mogelijke virale subtypen ^2. Human pandemieën van griep oorspronkelijk voort uit AIVs ^3. Veel dodelijke gevallen bij de mens tijdens de H5N1-uitbraken in de afgelopen jaren gemeld. De laatste tijd, een nieuwe AIV gerelateerde stam geveegd door de menselijke bevolking, waardoor de 'varkensgriep-epidemie' ^4. Hoewel de menselijke handel en transport activiteit lijkt te zijn verantwoordelijk voor de verspreiding van hoogpathogene stammen ^5, kan verspreiding ook deels worden toegeschreven aan wilde vogels ^{6, 7.} Echter, de werkelijke bron van alle stammen AIV is wilde vogels.

In reactie op deze en in het gezicht van ernstige commerciële verliezen in de pluimvee-industrie zijn er grote bewakingsprogramma's is wereldwijd geïmplementeerd om informatie over de ecologie van AIVs te verzamelen, en om systemen voor vroegtijdige waarschuwing te installeren om bepaalde hoogpathogene stammen ^8-12 op te sporen. Traditionele virologische methoden vereisen virussen intact en gecultiveerd voor de analyse. Dit vereist strenge koude ketens met diepvriezers en zware bioveiligheid procedures in de plaats worden tijdens het transport. Lange-termijn surveillance is dan ook meestal beperkt tot een paar veld stations dicht bij de goed uitgeruste laboratoria. Afgelegen gebieden kunnen niet worden bemonsterd, tenzij logistiek omslachtige procedures worden uitgevoerd. Deze problemen zijn erkend ^{13, 14} en het gebruik van alternatieve opslag en het transport van strategieën onderzocht (alcoholen of guanidine) ^15-17. Onlangs Kraus et al.. ¹⁸ introduceerde een methode voor het verzamelen, opslaan en vervoeren AIV monsters, gebaseerd op een speciaal filter papier. FTA-kaarten ¹⁹ te behouden RNA op een droge opslag basis ²⁰ en maken ziekteverwekkers inactief bij contact ^21. Deze studie toonde aan dat FTA kaarten kunnen worden gebruikt om de AIV RNA te detecteren in reverse-transcriptie PCR en dat de resulterende cDNA kan worden gesequenced en virus genen en bepaald.

In het onderzoek van Kraus et al.. ¹⁸ een laboratorium isoleren van de AIV werd gebruikt, en de monsters werden afzonderlijk behandeld. In het verlengde hier gepresenteerde werden fecale monsters van wilde vogels uit de eend val op de Ottenby Bird Observatory (SE Zweden) direct getest om de bruikbaarheid van de methoden te illustreren onder veldomstandigheden. Vangen van eenden en sample collectie van cloacaswabs is aangetoond. Het huidige protocol omvat het opschalen van het werk vloeien voort uit enkele buis hanteren om een ​​96-wells design. Hoewel minder gevoelig dan de traditionele methoden, de methode van de FTA-kaarten biedt een uitstekende aanvulling op grote surveillance regelingen. Het maakt het verzamelen en analyseren van monsters van overal in de wereld, zonder de noodzaak om het handhaven van een koelketen of veiligheidsvoorschriften met betrekking tot transport van gevaarlijke reagentia, zoals alcohol of guanidine.

Protocol

1. Eend Trapping en cloaca zwabberen

1. Trap dabbling eenden van het geslacht Anas (of andere vogels) in een kooi door ze te lokken met eenden te lokken of voedsel, en leg ze in afzonderlijke kartonnen dozen. Vervoer tijd in de box moet blijven tot een minimum beperkt, bijvoorbeeld door het installeren van een veldstation binnen een korte afstand van de val. Logistieke omstandigheden kunnen verschillen in elke studie. Het advies en de goedkeuring van de relevante dier ethische commissie moet worden gezocht voor elke nieuwe set-up. Als alternatief, ook de jager geschoten vogels kan worden bemonsterd.
2. Haal de eend uit de doos door de holding zijn vleugels vast aan zijn lichaam. Geniet van een frisse dropping, die aanwezig zal zijn in de meeste gevallen, direct vanaf de onderkant van de doos. Pak ze op met een steriel wattenstaafje en breng de vloeistof op een Whatman FTA-kaart. Zo niet, uit te voeren cloaca zwabberen.
3. Zet de eend op zijn rug. Dit maakt de toegang tot de cloaca en faciliteert bemonstering. De cloaca is een uitstekende structuur gelegen onder de buik, dicht bij de basis van de staart. Een ervaren persoon kan houden en de vogel monster op hetzelfde moment, of anders een tweede persoon kan helpen.
4. Steek de steriele plastic rayon wattenstaafje (Copan, Italië) ongeveer 1 cm en maak een zachte werveling van de cloaca. Rol het staafje met de vloeistoffen uit de cloaca over het oppervlak van een Whatman FTA-kaart. Na de monsterneming is uitgevoerd onmiddellijke vrijlating van het dier is wenselijk.
5. Droog de FTA kaarten bij kamertemperatuur gedurende tenminste een uur, daarna individueel op te slaan elk monster in papieren zakken (zoals enveloppen). Opslag is mogelijk op kamertemperatuur, eventueel met silica kralen in vochtige klimaten. Het verzenden en ontvangen instellingen bioveiligheid ambtenaren kunnen toestaan ​​om FTA kaarten versturen per post, want de ziekteverwekkers inactief bij contact met de FTA kaart oppervlak.

2. Viraal RNA isolatie

1. Pak de FTA kaart materiaal met inbegrip van de feces / cloaca vloeistof. Punch drie schijven met een Harris 2 mm puncher en plaats al die in een put van een RNase vrij 96well plaat. Tussen elke nieuw monster zorgvuldig schoon de puncher met alcohol en een Kim precisie wipe (Kimtech). Gebruik altijd positieve en negatieve controles. Een positieve controle kan bestaan ​​uit een laboratorium stam vers aangebracht op een FTA-kaart, of een natuurlijke steekproef die is bekend tot een positief resultaat opleveren. Als negatieve controle, punch-out discs uit een lege FTA-kaart. Bovendien, laat een ander ook vrij voor een PCR-controle later in je experiment (met water als sjabloon).
2. Voeg 70μl RNA snelle extractie-oplossing (Ambion) en warmte-seal de plaat (AbGene Thermo-Sealer). Incubeer 5 minuten op een shaker plaat bij kamertemperatuur met de vastgestelde snelheid die niet leidt tot spill-over (dit is afhankelijk van het gebruikte plaat shaker model te testen op voorhand).
3. Carry viraal RNA isolatie volgens de fabrikant de protocollen met de MagMAX-96 viraal RNA isolatie kit (Ambion). In het kort: Voeg 130μl bereid lysis / binding (uit de kit) in elk putje. Overdracht 50μl gewonnen FTA kaartmateriaal aan elke well. Schud plaat voor 1 minuut.
4. Voeg 20μl voorbereid kraal mix (uit de kit) aan elk monster en meng door en neer te pipetteren. Schud op bepaalde snelheid gedurende 5 minuten. RNA-moleculen binden aan de magnetische korrels.
5. Verplaats de plaat aan een magnetisch 96-well staan ​​om de kralen te vangen. Afhankelijk van het model van de gebruikte magnetische stand, kan dit meer dan 5 minuten. Wanneer de oplossing is veranderd helemaal duidelijk, te verwijderen en gooi de supernatant. Verwijder vervolgens de plaat uit de magnetische stand.
6. Twee keer was de korrels met wasoplossing 1 en tweemaal met wasoplossing 2 (uit de kit). Voor elk van de vier wasstappen 150μl bereid wassen oplossing toe te voegen aan elk monster, schud gedurende 1 minuut op bepaalde snelheid, de plaat naar de magnetische staan, vast te leggen kralen voor ongeveer 5 minuten (of totdat de oplossing is volledig helder), te verwijderen en Verwijder de bovenstaande vloeistof. Verwijder vervolgens de plaat uit de magnetische stand, voeg de volgende wasbeurt oplossing, en het uitvoeren van de wasstappen als voorheen. Na de laatste wasstap, verwijder zoveel wasoplossing als mogelijk en drogen de parels bij kamertemperatuur in de plaat shaker voor 2 minuten.
7. Voeg 50μl van elutie buffer (uit de kit) om RNA uit de kralen release en voor 4 minuten op de plaat shaker schudden. Capture parels zoals eerder beschreven. Het supernatant bevat nu de geïsoleerde RNA dat klaar is voor downstream-toepassingen.

3. RT-PCR van de AIV Matrix Gene

Het uitvoeren van reverse transcriptie PCR (RT-PCR) met de One-Step Access RT-PCR systeem (Promega) in 25 ul reacties (aangepast van Kraus et al. ¹⁸ en Fouchier et al. ^22..):

Nuclease gratis water	1.5μl
AMV / Tfl5 buffer
dNTPs	0.5μl
primer M52C 22 (10 uM)	2.5μl
primer M253R 22 (10 uM)	2.5μl
MgSO 4 (25 mm)	7μl
AMV reverse transcriptase (5u/μl)	0.5μl
TfL polymerase (5u/μl)	0.5μl
RNA-monster	5μl

5μl

PCR-condities in een Biometra T1 thermocycler zijn: de eerste reverse transcriptie van 45 minuten bij 45 ° C, gevolgd door twee minuten initiële denaturatie bij 94 ° C en 40 cycli van: 94 ° C gedurende 1 minuut, 56 ° C gedurende 1 minuut, en 68 ° C gedurende 2 minuten. Een extra 7 minuten rek bij 68 ° C concludeert de versterking.

4. Screening voor het AI-positieve monsters en zuivering van gerichte Fragmenten uit Gel

1. Belasting 2μl van het PCR-product gemengd met 2μl 5x het laden van kleurstof (BioRad) en 6μl water op een 1% agarose gel (Roche) gekleurd met 1% ethidiumbromide (2.5μl per 100 ml gel) voor een pre-screening.
2. Laat de gel gedurende 1 uur bij 120V, samen met een DNA grootte standaard (BioRad EZ load 100 bp ladder), visualiseren met een gel documentatiesysteem. Zie een voorbeeld in figuur 1.
3. Selecteer de monsters met geamplificeerde fragmenten in de verwachte omvang bereik (tussen de 200 bp en 300 bp (target fragment is 244 bp). Laad het volledige PCR-reactie volume (waarvan 23μl ~ zijn links) van deze kandidaten met 6μl 5x het laden van kleurstof op een 2 % ethidiumbromide gekleurde agarose gel en laat gedurende 2 uur.
4. Plaats de gel op een UV-transilluminator (Bioblock Scientific) en visueel geïnspecteerd. Zie een voorbeeld in figuur 2. Accijnzen bands van de juiste grootte van gel met een scalpel en geplaatst in de individuele 1,5 ml reageerbuizen. Zuiver fragmenten uit gel, bijvoorbeeld met de Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo Onderzoek).

5. Sequencing en identificatie van PCR producten

1. Het uitvoeren van Sanger sequentiebepaling van het doel fragmenten, bijvoorbeeld op een ABI 3730 capillaire sequencer met ABI Big Dye 3,1 chemie (Applied Biosystems). Bereid sequencing reacties in 10μl volumes met 10-20 ng gel-gezuiverd template cDNA, 1.75μl 5x verdunningsbuffer, 0.5μl Big Dye V3.1 premix, 1 ui voorwaartse primer (M52C ^20, 10 mM), en ddH2O. Fietsen voorwaarden zijn: 1 min initiële denaturatie, gevolgd door 25 cycli van: 10 s bij 96 ° C, 5 s bij 45 ° C en 4 min bij 60 ° C. Zuiveren en de voorbereiding van de sequencing reactie op basis van uw interne protocollen.
2. Identificeer resulterende cDNA sequenties tegen nucleotide databases zoals GenBank23, bijvoorbeeld door het web-gebaseerde tools zoals BLAST in het National Centre for Biotechnology Information (NCBI, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).

6. Representatieve resultaten:

Wilde eenden (Anas platyrhynchos) werden bemonsterd op Ottenby Bird Observatory in december 2007. Van elke mallard een monster FTA kaart werd genomen als beschreven in dit protocol. Na de levering, werden de FTA kaarten bewaard in een diepvries bij -20 ° C voor twee jaar. Dezelfde FTA-kaart monster van het laboratorium isoleren getest in Kraus et al.. ¹⁸ werd opgenomen als positieve controle, evenals negen tienvoudige seriële verdunningen van het. Twee negatieve controles werden i) extractie uit een lege FTA-kaart, om te testen of er was carry-over van de puncher, en ii) RT-PCR-reactie, waarin nuclease gratis water werd gebruikt als mal, om te testen of besmetting tijdens plaatsgevonden, of ter voorbereiding van de PCR-reactie.

84 monsters werden geanalyseerd. Een gel beeld van de PCR-producten van deze 84 monsters zijn te vinden in figuur 1. Van natuurlijke monsters een veelheid van niet-specifieke banden kan worden beïnvloed door de aanwezigheid van diverse microbiële verontreinigingen in de feces worden waargenomen. Echter, het doel fragment van de primerpaar is 244 bp lang. De hele PCR-reactie volume van een subset van de monsters die fragmenten geproduceerd in ongeveer de juiste grootte (tussen 200 bp en 300 bp) werd geladen op gel (figuur 1). Een illustratie van welke van de bands werden gesneden uit de gel kan worden gevonden in aanvullende figuur 1. In aanvulling op de positieve controle, twee van deze monsters (69.899 en 69.912) waren positief door het nieuwe protocol. Een BLAST zoeken tegen de NCBI databank nucleotide onthulde hun identiteit als AI-matrix-gen (Figuur 3), terwijl alle andere bands leek op bacteriële sequenties het best, of niet geven een leesbare volgorde helemaal.

Figuur 1. Gel beeld van een eerste screening van de PCR-producten. 2 pi PCR-product van positieve controle, serial verdunningen van de positieve controle, twee negatieve controles en 84 cloaca monsters werden geladen. 48 monsters zijn weergegeven in het bovenste paneel gel, en 48 monsters in het onderste paneel. Rode pijlen geven gel rijstroken gebruikt worden voor 100 bp DNA een standaardmaat. Ter illustratie, rode cirkels geven bands in de verwachte grootte bereik. Blauwe cirkels geven een niet-specifieke amplicon (links) of een primer dimeer artefact onder de 100 bp in grootte (rechtsonder).

Figuur 2. Selectie van monsters met fragmenten in de juiste afmetingen. Monsters met banden van 200 bp en 300 bp (target fragment 244 bp) werden gekozen. De groene pijl geeft de positieve controle, de twee rode pijlen geven monsters die werden bevestigd te AIV positief zijn door het vergelijken van de cDNA sequenties van de NCBI nucleotide database.

Figuur 3. Screen capture van een vertegenwoordiger van BLAST-zoekopdracht op NCBI. Een van de cDNA-sequenties die zijn verkregen uit de uitgesneden fragmenten werd opgevraagd tegen de nucleotide-database op de NCBI website. Het monster wordt correct geïdentificeerd als AI-Matrix genfragment. Om een grote versie van deze afbeelding wilt zien, klik hier.

Aanvullende Figuur S1. Bands van geselecteerde monsters uitgesneden uit gel. Deze foto is genomen uit de gel weergegeven in figuur 1 na de kandidaat-banden tussen de 200 bp en 300 bp werden uitgesneden.

Discussie

Het protocol hier beschreven biedt een aanvullende methode om fecaliën of soortgelijke monsters screenen op de aanwezigheid van de AIV. Het werd speciaal ontworpen om monstername snel en eenvoudig. Dit maakt het mogelijk voor minder getrainde personen, zoals jagers of wilde dieren managers, bij te dragen aan AI toezicht. Geen koele kettingen moeten worden toegepast, hoewel het bevriezen van de monsters wordt aanbevolen waar mogelijk. Een paar dagen van de ruimtetemperatuur, bijvoorbeeld tijdens het transport naar het laboratorium, waren geen probleem voor RNA-moleculen op FTA-kaarten, zolang de kaarten droog gebleven. Andere niet-gekoelde opslag systemen die momenteel worden geëvalueerd door de onderzoeksgemeenschap, zoals alcohol ¹⁵ of guanidine ^16, vereisen speciale scheepvaart regelingen vanwege hun gevaarlijke aard. In tegenstelling, heeft de FTA-kaart methode geen verschepen van gevaarlijke stoffen. Echter, een andere interessante opslagmedium in dit opzicht is RNAlater ™ dat niet gevaarlijk is, hetzij ^17. Monster analyse kan worden uitgevoerd in een standaard moleculair laboratorium. Geen speciale apparatuur anders dan voor normaal PCR-reacties en capillaire sequencing nodig was. Alle stappen kunnen worden uitgevoerd zonder een bioveiligheidsniveau, want al in monstername de mogelijke ziekteverwekkers werden geïnactiveerd door de antibacteriële en antivirale activiteit van de FTA kaart.

Kruisbesmetting en de daarop volgende fout-positieve monsters werden niet waargenomen in onze studies met wilde vogels monsters. Echter, bij het werken met RNA en PCR is het altijd raadzaam om speciale aandacht te besteden aan werkplekken en aparte kamers voor pre-en post-PCR stappen schoon te maken. Werken in een zuurkast verlaagt het risico van besmetting door aërosolen worden in het laboratorium. Pipetteren moet worden uitgevoerd met filter tips.

Uit een eerdere studie over monsters tegelijk uit dezelfde eenden weten we dat zes van de 84 monsters positief waren door de traditionele RealTime RT-PCR-methode ²⁴ en de Ct-waarden van RealTime RT-PCR zijn bekend. De twee positieve monsters gedetecteerd door onze methode vloeien voort uit eenden, die Ct-waarden <30 (met vermelding van een hoge concentratie van viraal RNA) had. De overige vier monsters die positief waren met de traditionele protocol had Ct-waarden> 30 (minder geconcentreerd) en kon niet worden gedetecteerd door ons protocol.

Alleen monsters met relatief hoge virus titers waren positief in onze test en het is waarschijnlijk dat de gevoeligheid van de methode was de bron van het niet alle positieve monsters op te sporen. Verder is de steekproefgrootte in de huidige studie was zeer laag en de methode kan volledig worden ontwikkeld en beoordeeld als er meer controle en strenge experimenten worden uitgevoerd. Echter, als deze monsters zouden zijn verzameld uit een afgelegen gebied, zou de traditionele analyse niet mogelijk zijn geweest helemaal. Bovendien, deze eerste resultaten komen voort uit pilot-experimenten die verdere optimalisatie nodig hebben. Een periode van twee jaar opslag in een reguliere -20 ° C vriezer na de monsterneming waarschijnlijk ook gevolgen voor de kwaliteit van het virale RNA. Dit is mogelijk RNA degradatie is een belangrijke kwestie bij de behandeling van kamertemperatuur opslag van geïnactiveerde virussen. Monsters worden opgeslagen in alternatieve vloeistoffen zoals hierboven vermeld last van significante afbraak die analyse van de langere stukken van het virale genoom ¹⁶ effecten. Hoewel niet getest in onze studie, hebben FTA kaarten bewezen goed geschikt zijn voor intact RNA-moleculen te behouden in andere RNA systemen die erg lijken op Aviaire Influenza virussen ^{25, 26.}

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens of het instrument	Vennootschap	Catalogus nummer	Commentaar (optioneel)
Plastic rayon droog wattenstaafje	Copan, Italië	167KS01
FTA-kaart	Whatman papier		verschillende opties
Harris micro-punch 2mm met mat	Whatman papier	1154409
RNase vrij 96well plaat	Greiner Bio-One	652290	of vergelijkbare
Kim precisie doekjes	Kimtech	75512
RNA snelle extractie-oplossing	Ambion	AM9775
MagMAX-96 virale isolatie kit	Ambion	AM1836
One-Step Access RT-PCR-systeem	Promega	A1250	of vergelijkbare
Agarose MP	Roche	1388991001	multi purpose agarose
5x laadbuffer	BioRad		geleverd met DNA-ladder
EZ load 100 bp ladder	BioRad	170-8353	of vergelijkbare
Ethidiumbromide 1%	Fluka	46067	of vergelijkbare
1,5 ml reactiebuizen	Eppendorf		of vergelijkbare
Zymoclean Gel DNA-herstel-kit	Zymo Onderzoek	D4001	of vergelijkbare
ABI grote kleurstof 3,1 chemie	Applied Biosystems		of vergelijkbare