Voorbereiding, Zuivering en karakterisering van lanthanide-complexen voor gebruik als contraststoffen voor Magnetic Resonance Imaging

Summary

We tonen de metalation, zuivering en karakterisering van lanthanide-complexen. De complexen hier beschreven kunnen worden geconjugeerd aan macromoleculen om het volgen van deze moleculen met behulp van magnetische resonantie beeldvorming.

Abstract

Polyaminopolycarboxylate-gebaseerde liganden worden vaak gebruikt om lanthanide-ionen-chelaat, en de resulterende complexen zijn bruikbaar als contrastmiddelen voor magnetische resonantie beeldvorming (MRI). Veel commercieel verkrijgbare liganden zijn bijzonder nuttig omdat ze functionele groepen bevatten die het mogelijk maken voor snelle, hoge zuiverheid en hoge opbrengst conjugatie van macromoleculen en biomoleculen via amine-reactieve geactiveerde esters en isothiocyanaatgroepen groepen of thiol-reactieve maleïmiden. Terwijl metalation van deze liganden wordt beschouwd als gemeenschappelijke kennis op het gebied van de bioconjugation chemie, subtiele verschillen in de metalation procedures moet rekening worden gehouden bij de keuze van metaal uitgangsmateriaal. Bovendien meerdere opties voor de zuivering en karakterisering bestaan, en selectie van de meest doeltreffende procedure gedeeltelijk afhankelijk van de keuze van de grondstoffen. Deze subtiele verschillen zijn vaak verwaarloosd in gepubliceerde protocollen. Hier is ons doel om aan te tonen gemeenschappelijke methoden voor het metalation, zuivering en karakterisering van lanthanide complexen die kunnen worden gebruikt als contrastmiddelen voor MRI (figuur 1). We verwachten dat deze publicatie in staat zal stellen biomedische wetenschappers lanthanide complexatie reacties te nemen in hun repertoire van de meest gebruikte reacties door het verlichten van de selectie van de grondstoffen-en zuiveringsmethoden.

Protocol

1. Metalation gebruik LnCl ₃ zouten

1. Los het ligand in het water aan een oplossing van 30-265 mM te produceren. Het ligand 2 - (4-isothiocyanatobenzyl)-diethyleentriamine pentaacetic zuur (p-SCN-Bn-DTPA) gebruikt werd in deze video met een concentratie van 73 mM.
2. Breng de pH van de oplossing van ligand aan tussen 5,5 en 7,0 door toevoeging van 1 M NH ₄ OH. In deze video werd 0,2 ml van de 1 M NH ₄ OH-oplossing gebruikt.
3. Los 1-2 equivalenten LnCl ₃ in water om een oplossing te produceren met een concentratie van 5-1000 mM. In deze video, zijn EuCl ₃ en GdCl ₃ gebruikt in concentraties van 111 mm. Een overmaat aan metaal wordt vaak gebruikt om de metalation rijden om de voltooiing en dus te vereenvoudigen zuivering.
4. Voeg de oplossing van LnCl ₃ aan de oplossing van het ligand tijdens het roeren.
5. Na de toevoeging van LnCl _3, de pH van het verkregen reactiemengsel tussen 5,5 en 7,0 door de toevoeging van 0,2 M NH ₄ OH. Een totaal van 0,5 ml van de 0,2 M NH ₄ OH-oplossing werd gebruikt in deze video. Als uw ligand bevat een zuur-gevoelige functionele groepen, de pH meerdere keren tijdens deze stap. LET OP - Als de oplossing wordt te basic, elke ondergrond gevoelig functionele groepen, zoals isothiocyanaat, zal worden onbruikbaar voor conjugatie.
6. Monitor de reactie via de pH-metingen. De reactie is voltooid wanneer de pH-waarde constant blijft.

2. Het verhogen van de pH workup (niet opgenomen in deze video, maar goed voor liganden zonder voet-gevoelige functionele groepen)

1. Voeg geconcentreerde NH ₄ OH aan het reactiemengsel om de pH aan te passen aan ≥ 11. Deze stap zal worden neergeslagen gecomplexeerde metalen als onoplosbare hydroxide.
2. Filtreer de bovenstaande vloeistof door een 0,2 um filter. Als het reactiemengsel verstopping van de filter, centrifugeren en decanteren voorafgaand aan de filtering wordt aanbevolen.
3. Als dialyse wordt niet uitgevoerd, oplosmiddel te verwijderen onder verminderde druk (roterende verdamping of vriesdrogen wordt aanbevolen).
4. Stappen 2.1-2.3 kan herhaald worden als vrij lanthanide blijft.

3. Dialyse workup

1. Snijd de dialyse slang aan op een juiste lengte (volg de richtlijnen van de fabrikant) om het sample volume te houden terwijl extra lengte (ongeveer 10% van de steekproef volume). In deze video, was een 100-500 dalton moleculair gewicht cut-off (MWCO) membraan gebruikt, maar grotere MWCO buis kan worden gebruikt als geschikt als conjugatie wordt uitgevoerd voorafgaand aan metalation. Ook kan dialyse cassettes worden gebruikt als een alternatief voor de dialyse buizen indien gewenst.
2. Indien van toepassing op basis van richtlijnen van de fabrikant, genieten van het gesneden dialyse slang in het water gedurende 15 minuten bij omgevingstemperatuur.
3. Vul een dialyse reservoir (een bekerglas van 1 liter werd gebruikt in deze video) met water (dialysaat). Het dialysaat volume moet ongeveer 100x die van het monster.
4. Vouw een uiteinde van de slang twee keer en zet het gevouwen gedeelte van de buis met een dialyse sluiting klem. Wikkel het einde van de sluiting met een rubberen band om ervoor te zorgen dat deze gesloten blijft tijdens de dialyse.
5. Filtreer het reactiemengsel door een 0,2 um filter, en laad het filtraat in het open uiteinde van de slang en let niet op de slang scheurt. Zorg ervoor dat u voldoende hoofd ruimte te laten aan de buis te sluiten.
6. Vouw de resterende open uiteinde van de slang dubbel, beveiligen met een sluiting, en de sluiting met een rubberen band als in stap 3.4 wrap.
7. Bevestig een glazen flacon met lucht om de klem op het ene uiteinde van de dialyse buis met een rubberen band. Bevestig een flacon met zand om de andere klem. Deze flesjes ervoor te zorgen dat de slang blijft ondergedompeld in het dialysaat.
8. Plaats de volledige buis in de dialyse reservoir dat dialysaat bevat.
9. Roer het dialysaat met behulp van een magnetische roer plaat bij een lage snelheid (geen vortexen) bij omgevingstemperatuur.
10. Verander het dialysaat 3x in de loop van een dag (in deze video, het dialysaat werd veranderd in 2,5, 6,5 en 11,5 uur), en laat dialyse te blijven 's nachts (voor een totaal van 20 tot 28 h van de dialyse).
11. Haal de dialyse slang van het dialysaat en zorgvuldig te openen een sluiting om het monster te verwijderen. Was de dialyse slang 3x met water en voeg de spoelvloeistof met het monster.
12. Verwijder het water onder verminderde druk. Vriesdrogen wordt gebruikt in deze video.

4. Beoordeling van de aanwezigheid van vrije metaal

1. Los het metaal complex in acetaat buffer (buffer voorbereiding: Los 1,4 ml azijnzuur in 400 ml water, breng de pH op 5,8 met 1 M NH ₄ OH, en voeg water toe tot een totaal volume van 500 ml te produceren) en voeg de xylenol oranje indicator (16 uM in pH 5,8 buffer). In deze video, was 0,3 mg complex opgelost in 0,3 ml buffer en 3 ml van de indicator-oplossing werd toegevoegd.
2. De aanwezigheid van vrije metaal via waarneming van een kleurverandering van de indicator van geel naar violet.
3. Indien gewenst, kan de hoeveelheid vrije metaal worden gekwantificeerd door het creëren van een kalibratiecurve ^1. Als alternatief kan de kleurstof arsenazo III worden gebruikt in plaats van xylenol oranje ^2. Als vrij metaal blijft, moet het monster verder worden gezuiverd met behulp van dialyse, een ontzouten kolom of high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) voorafgaand aan de karakterisering.

5. Bepaling van de water-coördinatie nummer (q)

1. Bereid een oplossing van de Eu ^{III-bevattende} complex (~ 1 mm) in H ₂ O en een andere oplossing van de zelfde concentratie in D ₂ O. Voorafgaand aan de analyse, moet de D ₂ O oplossing verdampt en opgelost in D ₂ O drie keer om de resterende H ₂ O. verwijderen
2. Voeg het water oplossing voor een schone cuvette, en plaats de cuvet in een spectrofluorometer.
3. Voer excitatie en emissie scans om de maxima te bepalen voor elke (~ 395 nm en 595 nm ~, respectievelijk).
4. Voer een fosforescentie tijd-verval experiment met behulp van de volgende parameters: excitatie en emissie golflengtes bepaald op basis van stap 5.3, excitatie en emissie sleuf breedtes (5 nm), flash tel (100), de eerste vertraging (0,01 ms), maximale vertraging (13 ms) , en vertraging toename (0,1 ms). Deze voorwaarden zijn geschikt voor de meeste complexen, maar de maximale vertraging en verhoging waarden kunnen worden verhoogd of verlaagd voor soorten met een extreem lange of extreem korte verval tijden.
5. Herhaal stap 5.4 met de D ₂ O-oplossing bereid in stap 5.1.
6. Van de luminescentie-gegevens over het verval is verkregen in 5.4 en 5.5, plot van de natuurlijke logaritme van de intensiteit versus tijd. De helling van deze lijnen zijn de decay rates (τ ^-1) (figuur 2). In deze video, is Microsoft Excel 2007 gebruikt om de natuurlijke log plots te genereren uit de ruwe data. Gebruik het verval tarieven in de vergelijking is ontwikkeld door Horrocks en collega's (eq 1) ^3. Als uw ligand bevat OH of NH groepen afgestemd op het metaal, dan is de vergelijking moet worden aangepast voor gebruik ^3.

eq 1:

6. Relaxatie metingen

1. Selecteer de gewenste toepassing-modus op de relaxatietijd analyzer: T ₁ (longitudinale relaxatietijd) of T ₂ (transversale relaxatietijd).
2. Bereid een reeks monsters met verschillende concentraties van Gd ^{III-bevattende} complex in een waterig oplosmiddel bevatten. In deze video, werd water gebruikt als oplosmiddel en oplossingen van 10.0, 5.00, 2.50, 1.25, 0.625, en 0 mM werden voorbereid. Andere waterige oplosmiddelen of buffers kunnen worden gebruikt, maar het is belangrijk om het oplosmiddel als de blanco. Het uiteindelijke volume van het monster is specifiek voor het instrument dat wordt gebruikt.
3. Plaats een monster in het instrument en laat het zitten voor 5 minuten in evenwicht om de temperatuur van het instrument (37 ° C in deze video).
4. Bepaal de relaxatietijd (in eenheden van s) door het aanpassen van de parameters van de software tot een gladde exponentiële curve voor T ₁ of T ₂ (vertegenwoordiger van bochten voor T ₁ en T ₂ zijn weergegeven in figuur 3) te verkrijgen.
5. Herhaal de stappen 6.3 en 6.4 voor alle monsters, met inbegrip van de blanco.
6. Bereken de inverse van de gemeten T ₁ of T ₂ waarden in eenheden van s ^-1.
7. Plot van de T ₁ ^-1 of ₂ ^-1 T-waarden ten opzichte van God ^III concentratie (in eenheden van mM). Door de hygroscopische karakter van Gd ^{III-bevattende} complexen, bevestigen de concentratie van God ^III, met behulp van atomaire absorptiespectrometrie of inductief gekoppelde plasma-massaspectrometrie. Past het perceel met een rechte lijn. Een vertegenwoordiger perceel is weergegeven in figuur 4.
8. De helling van de lijn is voorzien van de relaxatie (r ₁ of r ₂ voor T ₁ en T _2, respectievelijk) en heeft eenheden van mM ^-1 s ^-1.

7. Representatieve resultaten

Representatieve gegevens voor de stappen in dit protocol zijn opgenomen in de tabellen en figuren sectie. In aanvulling op de water-coördinatie nummer en relaxatie karakterisering beschreven in het protocol, is het belangrijk om karakteriseren eindproducten met behulp van standaard chemische technieken. De identiteit van de verbinding kan worden verkregen met behulp van massaspectrometrie, en representatieve massaspectra met de diagnose-isotoop patronen voor God ^III - en Eu ^{III-bevattende} complexen zijn weergegeven in figuur 5. Verder is het voor niet-Gd ^III lanthanide-bevattende complexen, kan NMR spectroscopie worden gebruikt voor de identificatie van het product. Om de zuiverheid van het complex, HPLC of elementaire analyse karakteriseren of beide kunnen worden gebruikt.

Figuur 1 Algemene regeling voor metalation en zuivering:. Scheme beeltenis van de algemene procedure voor metalation en de redenen voor het kiezen van verschillende zuivering routes.

Figuur 2 Luminescence-intensiteit plot:. Vertegenwoordiger plot van de natuurlijke logaritme van de intensiteit uitgezet tegen de tijd uit paragraaf 5. De hellingen van de lijnen gegenereerd op basis van gelijkaardige curves verworven voor water-en D ₂ O-oplossingen worden gebruikt met een eq van de water-coördinatie aantal EU ^{III-bevattende} complexen te karakteriseren.

Figuur 3 Ontspanning decay tijd curves:. Vertegenwoordiger van gegevens voor (links) T ₁ en (rechts) T ₂ acquisitie. Afwijkingen van deze curve vormen zou produceren onbetrouwbare gegevens.

Figuur 4 relaxatie bepaling:. Een vertegenwoordiger perceel van 1 / T ₁ versus de concentratie van God ^III. De helling van de lijn is voorzien van relaxatie en heeft eenheden van mM ^-1 s ^-1.

Figuur 5 Massaspectra:. Representatieve massaspectra met de diagnose-isotoop patronen voor (links) Gd ^{III-bevattende} complexen en (rechts) Eu ^{III-bevattende} complexen. De zwarte Gaussiaanse pieken vormen de theoretische isotoop distributie en de rode lijnen zijn de actuele gegevens.

Discussion

Gezien het toenemende aantal publicaties dat lanthanide-gebaseerde contrastmiddelen ^4-14 omvatten, is het belangrijk dat zorg wordt besteed bij de voorbereiding, het zuiveren en karakteriseren van producten aan reproduceerbare en vergelijkbare resultaten te garanderen. Deze complexen worden vaak beschouwd als een uitdaging om te zuiveren en ten opzichte van organische moleculen als gevolg van hun paramagnetisch de natuur en de gevoeligheid van een functionele groepen die kunnen worden gebruikt voor bioconjuga...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagentia en apparatuur	Vennootschap	Catalogus nummer
EuCl 3 • 6H 2 O	Sigma-Aldrich	203254-5G
p-SCN-Bn-DTPA	Macrocyclics	B-305
ammonium hydroxide	EMD	AX1303-3
Spectra / Por Biotech cellulose-ester (CE) dialysemembraan - 500 D MWCO	Fisher Scientific	68-671-24
Millipore IC Millex-LG Filter Units	Fisher Scientific	SLLG C13 NL
xylenol oranje tetranatriumzout	Alfa Aesar	41379
azijnzuur	Fluka	49199
D 2 O	Cambridge Isotope Laboratories, Inc	DLM-4-25
waterzuiveraar	ELGA	Purelab Ultra
high performance liquid chromatografie en massaspectrometrie	Shimadzu	LCMS-2010EV
relaxatietijd analyzer	Bruker	mq60 minispec
UV-VIS spectrofotometer	Fisher Scientific	20-624-00092
vriesdroger	Fisher Scientific	10-030-133
pH-meter	Hanna Instruments	HI 221
Spectrofluorometer	HORIBA Jobin Yvon	FluoroMax-4
Moleculair gewicht Calculator versie 6.46 van Matthew Monroe, gedownload 17 oktober 2009	http://ncrr.pnl.gov/software/	Moleculair gewicht Calculator