Methode voor het nieuwe anti-kanker medicijn ontwikkeling met behulp van Tumor Explantaten van Chirurgische Specimens

Samenvatting

Hier hebben we een methode om de werkzaamheid van drugs testen met chirurgische exemplaren van hersentumoren, aangeduid als "tumor explant methode". Met deze methode kunnen we werkzaamheid van het geneesmiddel te evalueren zonder het breken van de micro-omgeving van solide tumoren. Te valideren betrouwbaarheid van deze methode, beschrijven we representatieve gegevens met onze glioom monster behandeld met de huidige eerste lijn chemotherapeuticum, temozolomide.

Samenvatting

De huidige therapieën voor maligne glioom hebben alleen palliatief effect. Voor therapeutische ontwikkeling, een hindernis is het verschil van effectiviteit bepaald door de huidige drug werkzaamheid van tests en de werkzaamheid bij patiënten. Zo worden nieuwe en betrouwbare methoden voor het evalueren van de werkzaamheid van drugs gegarandeerd in pre-klinische fase. In vitro cultuur van de tumor weefsels, waaronder cellijnen, heeft aanzienlijke fenotypische, genetische en epigenetische veranderingen van kankercellen veroorzaakt door de kunstmatige omgeving van de cel cultuur, die mogelijk niet overeen met de biologie van de originele tumor in situ. Xenotransplantaatmodellen met de immunodeficiënte muizen hebben ook beperkingen, dat wil zeggen, het ontbreken van immuunsysteem en interspecies genetische en epigenetische verschillen in micro-omgeving. Hier tonen we een nieuwe methode met behulp van de chirurgische exemplaren van kwaadaardige glioma als ongedissocieerde tumor blokken om effecten van de behandeling te evalueren. Om deze methode te valideren, zijn de gegevens met de huidige eerste lijn chemotherapeutische middel, temozolomide (TMZ), beschreven.

We gebruikten de vers-chirurgische verwijderde exemplaar van een maligne glioom voor onze experimenten. We uitgevoerd intratumorale injectie van TMZ of andere kandidaat-geneesmiddelen, gevolgd door een incubatie-en analyse op chirurgische exemplaren. Hier zochten we naar een tumor weefsel explantatie methode vast te stellen als een platform om de werkzaamheid van nieuwe anti-kanker therapieën te bepalen, zodat we in staat zijn om te overwinnen, op zijn minst een deel van de huidige beperkingen en de bestaande kloof tussen de huidige experimentele te vullen gegevens en de werkzaamheid op de tumor een echte patiënt. Deze methode kan de potentie hebben om te versnellen het identificeren van nieuwe chemotherapeutica voor vaste behandeling van kanker.

Protocol

1. Voorbereiding van de media

1. De media werd bereid met 10% FBS (16140-071 - GIBCO) in DMEM/F-12 (1X), Liquid 01:01 (10565-042 - Invitrogen) met 0,6% Agar gezuiverd, Gegranuleerde (1.01614.1000-EMD ). Steriele omstandigheden werden gehandhaafd gedurende het experiment.
2. Voor de bereiding van media 5 ml van de FBS (16.140-071 - GIBCO) werd toegevoegd aan 45 ml van DMEM/F-12 (1X), Liquid 01:01 (10565-042 - Invitrogen), waardoor uiteindelijk volume van 50 ml. De bereide media werd bewaard in een waterbad bij 37 ° C temperatuur.
3. De agar-oplossing werd bereid met behulp van warmte magnetron methode. 0,3 gram kristalsuiker agar werd opgelost in 50 ml gedestilleerd water met behulp van een magnetron. De agar-oplossing werd afgekoeld tot 37 ° C temperatuur door hem in het water bad.
4. We gebruikten gelijk volume van de media uit stap 1.2 en 1.3 en voorbereid stamoplossing. De verhouding van 0,6% agar (0,5 ml) en 10% FBS-D-MEM/F-12 media (0,5 ml) was 1:1, waardoor het totale volume van 1 ml in elke well van 6 well platen.

2. Tissue verwerking

1. Glioblastoma multiforme (GBM) weefsels werden ontvangen direct na de operatie van de afdeling Pathologie. Het weefsel werd geclassificeerd als GBM van de afdeling Pathologie.
2. Het weefsel werd overgebracht naar patri-plate met behulp van pincet voorzichtig en gewassen met ijskoude 5 ml 1XPBS voor 3 keer.
3. Seriële secties van de specimens werden gesneden uit de ontleed monsters van de tumor blokken (ongeveer 10 mm in diameter) met een chirurgisch mes (Feather-2976 # 10) en pincet (Fisher Scientific) te creëren.
4. Blokken werden overgebracht naar een 6 wells plaat. Elk putje werd met 1 ml van de media te vermelden in stap 1.4. Het weefsel had genoeg blootstelling aan de lucht te houden weefsel levensvatbaar te maken.
5. Tumor blokken werden vervolgens geïnjecteerd met ofwel DMSO (5%) of TMZ (2,5 nM) en geïncubeerd gedurende 16 uur bij 37 ° C in bevochtigde lucht met 5% CO2. 0,1 ml van DMSO (5%) of TMZ werd geïnjecteerd drie keer in de tumor blokken op verschillende plaatsen voor consistente behandeling. Het medicijn werd geïnjecteerd met behulp van insuline spuit 1 ml 0.37X12.7mm 28G1 / 2 (Comfort point-26027).
6. Na 16 uur blokken werden gewassen met 5 ml 1XPBS voor 3 keer. Na het wassen de blokken werden met 10 ml 10% v / v formaline gedurende 24 uur (Ricca chemisch bedrijf) in 50 ml buizen (Basix-5539802) en verwerkt voor paraffine ingebedde 4μm secties.
7. De formaline vaste gedeelte werd geplaatst in bekerglas op de roer plaat met "NO HEAT" en verwerkt door middel van de volgende oplossingen voor 30 minuten in elke oplossing. 30% ethanol, 50% ethanol, 75% ethanol, 80% ethanol, 95% ethanol, 100% ethanol, en Xyleen.
8. Het weefsel werd uitgewist op keukenpapier en geplaatst in gesmolten paraffine (58 tot 60 ° C, Fisher Paraplast paraffine) gedurende 30 minuten.
9. Het weefsel werd ingebed in mallen met behulp van Surgipath Blue Ribbon paraffine, was ingebed weefsel gekoeld tot kamertemperatuur.
10. Paraffine ingebedde 4μm weefselcoupes werden genomen en op Fisher Plus dia's.

3. Immunohistochemie

Immunohistochemie werd uitgevoerd zoals eerder beschreven ^1.

1. Deparaffinization en rehydratatie Plaats de objectglaasjes in een rack en voer volgende stappen uit. Xyleen voor de 3x5 minuten (3 keer voor 5 minuten), 100% ethanol voor de 3x5 minuten, 95% ethanol voor de 1x5 minuten, 70% ethanol voor de 1x5 minuten, spoel onder stromend leidingwater gedurende 3 minuten.
2. Antigen herstel met warmte geïnduceerd herstel van de epitoop Dompel dia's in 1X citraatbuffer (Thermo-wetenschappelijke AP9003-500) opgelost in gedestilleerd water in een bekerglas. Kook gedurende 15 minuten op een hete plaat (zorg ervoor dat delen don "t vallen van de dia). Koel de oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Spoel de dia's met 1X PBS voor de 3x5 minuten.
3. Remming van de interne peroxide Dompel de dia's in methanol (Fisher Scientific-A-452-4) met 0,3% waterstofperoxide (Fisher Scientific-BP2633-500-opgelost in gedestilleerd water) in een bekerglas gedurende 15 minuten. Spoel in 1X PBS voor de 3x5 minuten.
4. Het blokkeren van Bedek de weefsels met 10% normaal geit serum. Overdracht van de dia's in een vochtige doos en incubeer 1 uur bij kamertemperatuur. Was de dia's met 1X PBS voor de 3x5 minuten.
5. Primair antilichaam Secties werden gedurende de nacht geïncubeerd bij 4 ° C met een primair antilichaam op volgende concentraties: de menselijke specifieke caspase-3 (1:1000, R & O-systemen, AF835), Ki67 (1:1, Dako, 15.626), verdund met 1X PBS. Spoel de dia's in 1X PBS 3x10 minuten op de volgende dag.
6. Secundair antilichaam reactie Bedek de weefsels met 2-3 druppels van de HRP gelabeld secundair antilichaam (Envision systemen). Zet dia's in een vochtige doos en incubeer 1 uur bij kamertemperatuur. Was met 1X PBS voor 3x10 minuten.
7. Detectie te ontwikkelen voor de chromogeen DAB kit (Vector laboratoria-SK-4100) voor de detectie van primaire antistof volgende protocol van de fabrikant.
8. Counter vlekken Dompel de dia's met hematoxyline (10-15 s econden, zorg ervoor dat don "t overrun DAB-signaal). Afspoelen met leidingwater gedurende 3 minuten.
9. Uitdroging Dompel de dia's in volgorde, 70% ethanol gedurende 5 minuten, 95% ethanol gedurende 5 minuten, 100% ethanol voor de 3x5 minuten, Xyleen voor 3x5 minuten.
10. Dekglas de dia's met Permount montage reagens (Fisher Scientific-SP-15-100).
11. Beelden werden gemaakt met behulp van Olympus fluorescentiemicroscoop (DP-72) .3.11). In alle experimenten werd specifieke etiketteringsvoorschriften bevestigd door de negatieve controle zonder primaire antilichaam.

4. Representatieve resultaten:

We verzamelden chirurgische exemplaren van glioblastoma multiforme (GBM). De patiënten ondergingen de eerste operatie zonder voorafgaande chemotherapieën waaronder temozolomide (TMZ). De T1-gewogen beeld van de MRI met gadolinium verbetering in de figuur-1a toonde een verhoogde tumor in de rechter frontale kwab voor de operatie. De postoperatieve afbeelding (figuur-1b) bevestigde subtotaal verwijdering van de laesie na de operatie. De chirurgische weefsels werden gestuurd naar de afdeling Pathologie van de klinische diagnose doel, en de resterende exemplaren werden verwerkt tot de weefselverkrijging kader van de goedgekeurde Institutional Review Board (IRB) protocol aan de Ohio State University Medical Center. Hematoxyline en eosine (H & E) kleuring toonde de aanwezigheid van necrose, pseudopallisading cellen, en microvasculaire proliferatie (figuur 1-c). Zo werden deze tumoren histopathologisch gediagnosticeerd als GBM. Van de nota, tumor explantaten na incubatie zonder TMZ tot 48 uur handhaafde de cytoarchitecture van GBM. In tegenstelling met incubatie gedurende 72 uur of langer, hebben we de toename van het aantal van de gecondenseerde kernen in de exemplaren gemerkt, suggereert een deel van de tumorcellen begint te ondergaan apoptose. Als gevolg hiervan tumor weefsel na langere incubatietijd die fragmentarisch regio's die tumorcellen, die bij voorkeur werden waargenomen op en rond de necrotische gebieden (gegevens niet getoond) verloren gaat.

Om te onderzoeken of deze tumor explantatie monsters betrouwbaar kan worden gebruikt voor het doel van de werkzaamheid van het geneesmiddel test, testten we het effect van TMZ behandeling. Figuur 2 geeft de stroom van de experimenten in deze studie. Een recente studie toonde aan dat intratumorale injectie van TMZ krachtiger effect op de groei controle van kwaadaardig glioom is dan dat van de systemische toediening van dit medicijn ^2. Na incubatie gedurende 16 uur, werden deze explantaten ingebed met paraffine en seriële secties werden voorbereid voor kleuring. Immunohistochemie van de TMZ-behandelde GBM weefsels toonde een substantiële reductie van de Ki-67-positieve tumorcellen in vergelijking met de controle monsters. Op zijn beurt heeft immunohistochemie met een apoptose marker, caspase-3, geen significante verschillen tussen de TMZ-behandelde glioom exemplaren en de controle monsters (figuur-3).

Effect van de behandeling met TMZ werd verder gekenmerkt door het combineren van deze explantatie test samen met ofwel in vitro cultuur of flowcytometrie. In het bijzonder, zochten we naar het effect op stamcel-achtige tumorcellen (SCLTC) te bepalen. Daarom, na intratumorale behandeling met TMZ, voerden we bol vormen assay en flow cytometrie van deze tumor explantaten. De TMZ-behandelde monsters werden gescheiden in individuele enkele cellen en deze enkele cellen werden uitgezaaid in een lage dichtheid (een cel per microliter of lager) in 96-well platen in serum-vrij medium aangevuld met bFGF en EGF. In de controlegroep, was de vorming van de tumor sferen van de tumor explantaten waargenomen na 7 dagen incubatie. Gezien het feit dat bol formatie is een eigenschap van SCLTC ^{3 4,} wijzigingen in het aantal tumor bollen door een medicamenteuze behandeling geeft het effect op de SCLTC. Evenzo werd flowcytometrie van de gedissocieerde tumor explantaten met een celoppervlak marker, CD133, uitgevoerd om het effect te controleren op de SCLTC. Als SCLTC in heterogene tumorcellen in GBM worden selectief uitgeroeid door een behandeling met geneesmiddelen, zou men kunnen voorspellen dat flow cytometrie moet afname van de CD133-positieve fractie te detecteren door de behandeling (gegevens niet getoond).

Figure.1 magnetische resonantie beelden (MRI) van een patiënt GBM. Representatieve cijfers van de inspectie voor het figuur-1a en na de operatie figuur-1b. Figuur-1c is H & E kleuring van verse GBM weefselmonster. Originele vergroting, 40X.

Figuur. 2 De experimentele stroom van blok cultuur experiment. Figuur-2a. Afbeelding van verse chirurgische GBM ontvangen van de afdeling pathologie. Figuur-2b toont Dissectie van tumor blok in 10 mm kleine stukjes met de hulp chirurgisch mes. Figuur-2c is de drug (TMZ) behandeling van tumor blokken met behulp van insuline spuit.

e 3 "/>
Figuur. 3 Immunohistochemie. Immunohistochemie van GBM weefsel blokken geïnjecteerd met DMSO of TMZ met geactiveerde caspase-3 en Ki67. Hematoxyline werd gebruikt voor nucleaire kleuring. Originele vergroting, 40X.

Discussie

Er is een kloof tussen de werkzaamheid van drugs in de huidige pre-klinische experimentele modellen en de werkzaamheid bij patiënten. Meer specifiek in de hersenen tumor gebied van onderzoek, zijn nieuw en betrouwbare methoden nodig dat zou helpen opvullen van de bestaande kloof tussen de drug evaluatie met de huidige methoden en de werkzaamheid bij patiënten. De beschreven test in deze studie is een bijkomende troef, zo niet een oplossing, ter vergemakkelijking van het vullen van de discrepantie van de experimentele gegevens en het resultaat van de getroffen patiënten.

In vitro celculturen bij voorkeur bepaalde tumoren celtypen uit te breiden, ongeacht de kweekomstandigheden, en vertegenwoordigen ze slechts een subpopulatie van de gehele tumor. ^Vijf Daarnaast, genetische en fenotypische transformatie van de kunstmatige cel expansie optreedt en is onvermijdelijk met de lange-termijn celculturen . Een van de belangrijkste obstakels om kwaadaardig glioom te behandelen is de heterogeniteit van tumorcellen, zowel binnen een tumor en tussen de tumor samples ^{6, 7.} Daarom, selectieve verrijking van een bepaalde populatie van tumorcellen, ongeacht het een type of een ander, wellicht niet een geschikt middel om de effectiviteit van chemotherapeutica op heterogene tumor cellen te bepalen. ^{8 9} Een diermodel van hersentumoren afgeleid van een subpopulatie van tumorcellen werpen licht op de werkzaamheid van drugs op een subpopulatie, maar niet de hele tumor.

Een aantal beperkingen, aan de andere kant, nog steeds in deze tumor explantatie methode. Een van deze beperking is de relatief korte periode van de behandeling. Sinds kwaadaardige tumorcellen worden beschouwd als resistent worden voor de meeste, zo niet alle, therapieën na verloop van tijd, de eerste controle van de korte termijn de groei van tumorcellen kan niet worden weergegeven door de lange termijn prognose patiënt, werd zoals onlangs gemeld met een anti- angiogene agent, bevacizumab ^10. Zo is verbetering van het protocol voor dit explantatie test om weefsels voor een langere periode te bewaren vereist nader onderzoek. Een andere vraag is een specifiek effect van een geteste geneesmiddel op SCLTC in de tumor. Gezien het feit dat SCLTC relatief goed bestand tegen de huidige therapieën voor maligne glioom, de identificatie van nieuwe anti-kanker geneesmiddelen die krachtig uit te roeien SCLTC is gerechtvaardigd. In dit verband hebben we op dit moment trachten dit explantatie test te combineren met de volgende in vitro experimenten, zoals het vormen van neurosphere assay (gegevens niet getoond). We verwachten om meer te leren over de effecten, indien aanwezig, van een kandidaat-geneesmiddel op SCLTC door middel van deze gecombineerde testen. Ten slotte kan het gebruik van kleine blokken van tumormonsters geen afspiegeling van de gehele tumor cel populaties, zoals het geval is met de conventionele tumor cellijnen of primaire culturen van chirurgische exemplaren. Deze kwesties terzijde, het behoud van tumor stroma, met inbegrip van de vasculaire niche, is handig bij het karakteriseren van de omgevingsfactoren voor de tumorcellen. Daarom kan deze test de potentie hebben om een ​​therapeutische strategieën te evalueren onder een meer fysiologisch relevante conditie.

Hier, hebben we een test voor de werkzaamheid van drugs testen met explantaten van chirurgische exemplaren van GBM. In feite, met de geteste exemplaren chirurgische, vonden we dat een directe injectie van TMZ proliferatie in de GBM monsters vermindert. Dit weefsel explant methode is theoretisch van toepassing op andere vaste vormen van kanker en biedt asset om te bepalen werkzaamheid van het geneesmiddel op de tumor van een patiënt, die hopelijk ons ​​zal helpen te vermijden een ander falen in klinische studies voor kanker.

Materialen

Naam van het serum	Vennootschap	Catalogus nummer
Foetale Bovine Serum, Qualified, hitte-geïnactiveerd	GIBCO	16140-071
D-MEM/F-12 (1X) Liquid 01:01	Invitrogen	10565-042
Agar-agar Gezuiverd, Gegranuleerde	EMD	1.01614.1000
DPBS voor kleuring	Invitrogen	14190
Hematoxyllin	Richalrd allan sci	7211
10% w / v formaline caspase-3	Ricca chemisch bedrijf	3810
Caspase-3	O & O-systemen	AF835
Ki67	Dako	15626
DMSO	Sigma	D2650
Envision systeem-anti-muis	Dako	2012-07
Envision systeem-anti-konijn	Dako	2011-12
DAB-kit	Vector Lab.	SK-4100

Tabel 1. Materials.

Naam van het apparaat	Vennootschap	Catalogus nummer
6 wells plaat	Greiner bio-een	657160
Petrischaal	VWR	25384-302
Serologische pipet	Axygen
Filter tips	USA wetenschappelijke
500 pm polyester mesh Netwell insert	Costar	3480
Matrigel Matrix	BD Biosciences	354230
BD 10 ml spuit	BD Biosciences	309604
Injectienaald Aluminium Hub.	Tyco Health Care	2000029
Weefselkweek fles	Corning
Centrifugebuisjes	Basix	5539800
Dunwandige buizen	Eton	1107A
Chirurgisch Blade roestvrij staal	Veer	2976 # 10
Insulinespuit	Comfort punt	26027
50ml vlakke bovenkant schroefdop tube	Basix	5539802
Dissection microscoop	TriTech
Fluorescentie microscoop	Olympus	DP-72
Pincet	Fisher Sci

Tabel 2. Equipment.