Low-Cost Cryo-Light Microscopie Stage Fabrication voor Gecorreleerde Light / Electron Microscopy

Samenvatting

Tonen we de fabricage van een low-cost cryogene trap is ontworpen om de meeste gereflecteerde licht microscopen te passen. Dit lab-built cryogene stage maakt een efficiënte en betrouwbare correlatieve beeldvorming tussen de cryo-licht-en cryo-elektronenmicroscopie.

Samenvatting

De koppeling van de cryo-lichtmicroscopie (cryo-LM) en cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) stelt een aantal voordelen voor het begrijpen van cellulaire dynamiek en ultrastructuur. Ten eerste kan cellen worden afgebeeld in een near-native omgeving voor beide technieken. Ten tweede, als gevolg van de verglazing proces worden monsters die door de snelle fysieke immobilisatie in plaats van langzame chemische fixatie. Ten derde, imaging van hetzelfde monster met beide cryo-LM en cryo-EM biedt correlatie van gegevens uit een enkele cel, in plaats van een vergelijking van de 'representatieve steekproeven ". Hoewel deze voordelen zijn bekend uit eerdere studies, de wijdverbreide gebruik van correlatieve cryo-LM en cryo-EM blijft beperkt als gevolg van de kosten en complexiteit van het kopen of bouwen van een geschikte cryogene lichtmicroscopie podium. Hier laten we zien de montage en het gebruik van een goedkope cryogene stadium dat kan in ieder laboratorium worden vervaardigd voor minder dan $ 40 met onderdelen vinden op de lokale hardware en supermarkten. Deze cryo-LM podium is ontworpen voor gebruik met gereflecteerd licht microscopen die zijn uitgerust met lange werkafstand lucht doelstellingen. Voor de correlatieve cryo-LM en cryo-EM studies, passen we het gebruik van carbon gecoat standaard 3 mm cryo-EM grids als specimen ondersteunt. Na het adsorberen van het monster aan het net, zijn eerder vastgestelde protocollen voor vitrifying het monster en de overdracht / het hanteren van de rooster gevolgd om multi-techniek beeldvorming mogelijk te maken. Als gevolg daarvan, deze setup kan elke laboratorium met een gereflecteerd licht microscoop om toegang te hebben tot de directe correlatieve beeldvorming van bevroren gehydrateerd monsters.

Protocol

1. Fabricage en assemblage

1. Plaats het aluminium koellichaam in de 22,96 cm (9 ") pie pan ongeveer 2 cm van de zijkant van de pan, zoals weergegeven in figuur 1c Met behulp van een zwarte marker pen, markeer de gaten voor de aluminium koellichaam Let op:.. Als het aluminium blok (gekocht bij een lokale schroot winkel of online op http://www.onlinemetals.com ) wordt niet geleverd met voorgeboorde gaten, moet u regelen dat hebben gaten geboord en vóór verzonken naar stap 1 om de aluminium beveiligen blok naar de taart pan. We gebruikten 5 gaten om het blok vast te zetten van het platform en 4 extra gaten om stikstof gasbellen om te ontsnappen uit onder het aluminium.
2. Plaats de cryo-grid box in de buurt van de locatie van het aluminium koellichaam en markeer de inkeping en elke kant.
3. Boor gaten voor elke gemarkeerde positie met behulp van een # 17 boor voor de aluminium koellichaam holes en een # 35 boor voor de cryo-grid box gaten.
4. Monteer de aluminium koellichaam met behulp van 5 - # 10, 1,9 cm (3 / 4 ") platte kop gleuf bouten en moeren bijbehorende evenals 15 - # 10 ringen Plaats twee ringen onder het aluminium blok en de derde op de achterzijde van de. pie pan voor elke hole. Opmerking: Ongedekte overhangen van het aluminium blok in de buurt van het zichtbare gebied kan leiden tot trillingen, die beeldvorming mogelijkheden van het podium te beperken Controleer of alle bevestigingsbouten goed vastgedraaid..
5. Plaats 3 - # 4, 0,95 cm (3 / 8 ") ronde sleuven bouten en bijbehorende moeren van de achterkant van de pie pan te treden als de cryo-grid box te monteren.
6. Tape 4 eetstokjes samen in paren met een eetstokje bovenop elkaar. Tape elk paar de tegenovergestelde randen van de taartvorm op te treden als afstandhouders.
7. Nat de boven-en onderkant van de cake en taart pannen met respectievelijk DDH ₂ O.
8. Vul de taartvorm met twee lagen van isolerend schuim spuiten. Bevochtiging elke laag voordat u naar de volgende stap.
9. Druk op de taart pan in het schuim.
10. Flip de pannen ondersteboven en druk op de taart pan tot de afstandhouders contact op met de pie pan. Plaats geen gewogen object boven op de cake pan en laat zitten 's nachts te genezen.
11. Met een gekarteld mes, wegsnijden van de overtollige gedroogde isolerende sproeischuim van de rand van de pannen en verwijder de eetstokjes.
12. Haal de taartvorm uit de taart pan. De taart pan met aluminium koellichaam is nu geïsoleerd en wordt aangeduid als de "cryogene stage" (afb. 1a).
13. Plaats een doorzichtige plastic klembord (welke kleur en groter dan 3 mm dik) over de bovenkant van de cryogene podium. Markeer met een zwarte stift de locatie van de cryo-grid box monteren door het tekenen van een cirkel van ongeveer 1,5 maal de diameter van een enkele ronde cryo-grid box. Knip gat met een 1,9 cm (3 / 4 ") gatenzaag. Klembord Deze zal worden aangeduid als de" laadscherm "(afb. 1b).
14. Doe een nieuwe transparante klembord op de hoogte van de cryogene podium en plaats op de microscoop met het koellichaam direct onder de objectief lenzen. Met een zwarte stift, markeren het pad van de doelstellingen zoals ze draaien.
15. Snijd langs de gemarkeerde lijn het verwijderen van een halve cirkel van de rand van het klembord. Dit kan worden bereikt met een decoupeerzaag of met behulp van een 7,62 cm (3 ") gat zagen meerdere keren, zoals in de video.
16. Eindelijk gesneden een 1,9 cm (3 / 4 ") gat afstand van de halve cirkel, maar nog steeds binnen het gebied van de schotel. Dit zal de poort worden voor het bijvullen van vloeibare stikstof (lN ₂₎ als daalt, terwijl beeldvorming. Klembord Dit zal worden verwezen als de "beeldscherm" (afb. 1c).

2. Monstervoorbereiding

1. Verdunnen log-fase gistcellen gekweekt in synthetische complete (SC) media om een geschikte concentratie van 1x10 ⁶ cellen / ml in water.
2. 2 ml van de verdunde gist worden gepipetteerd op een R2 / 1 400 mesh essen carbon beklede koperen cryo-EM grid (SPI Supplies, West Chester, PA) en laten adsorberen gedurende 15 seconden.
3. Blot overtollige vloeistof van de grid oppervlak door het aanraken van de achterkant van de grid op een afgescheurd stukje zachte cellulose weefsel (Kimwipe) gedurende 2 seconden.
4. Indien nodig, kan het net worden gewassen met 3 pi druppels water (1-3 keer), en de goddeloze weg als in stap 3 door blotting van de achterkant.
5. Voorafgaand aan de finale te wassen, wordt het monster geladen in de pneumatische duik vriezer en de opknoping rooster wordt gewassen zoals in stap 2.4. Na blotting het rooster met een gescheurde tissue papier (Kimwipe) de meerderheid van het water te verwijderen van het oppervlak, is het net ondergedompeld in lN _twee gekoelde vloeibare ethaan en overgebracht naar een cryo-grid box voor opslag ^1. Opmerking: het is belangrijk om Laat een laagje vloeistof zo dun mogelijk aan de oppervlakte te houden het monster gehydrateerd. Onjuiste blotting zal ofwel uitdrogen van het monster of laat ijs dat is ondoorzichtig voor de elektronenbundel.

3. Cryo-Light Microscopie

1. Vul de cryogene podium metlN ₂ en snel te bedekken met het laadscherm (plastic klembord met een 1,9 cm (3 / 4 ") gat).
2. Zodra de metalen bereikt lN ₂ temperatuur, de overdracht van de cryo-grid box door middel van de 1,9 cm (3 / 4 ") gat van de laad-scherm en in de overdracht berg die door de 3 schroeven in deel A5. Draai de cryo-grid box uit de houder en verwijder de houder voor een betere toegang. Houd de cryo-grid box houder onder lN ₂ in een aparte Dewar tot stap 3.10. De cryo-grid box moet ook worden gehouden lN ₂ tot en met monster raster opwarming te voorkomen.
3. . Vullen lN ₂ in de cryogene podium tot net onder de top van het aluminium koellichaam Opmerking: lN _twee niveaus moeten periodiek worden gecontroleerd en opnieuw gevuld tijdens het beeldvormingsproces om ervoor te zorgen lN ₂ is voortdurend in contact met het koellichaam. In het algemeen, het bijvullen gebeurt elke 10 minuten via de haven in te vullen het beeldscherm.
4. Pre-cool de pincet tip in lN _2, vervolgens over je rooster (s) op de vlakke bekijken oppervlak van het aluminium koellichaam met een pincet, het gebruik van de 1,9 cm (3 / 4 ") opening van het laadscherm.
5. Voorzichtig gaan de cryo-podium om onder de doelstelling van de gereflecteerde licht microscoop openingen.
6. Plaats het transparante beeldscherm boven het laadscherm. Dan langzaam Verwijder de laad scherm door te schuiven onder het beeldscherm. NB: Op dit punt, het monster is het meest kwetsbaar. Alle lucht stromingen rond de microscoop moet worden geminimaliseerd, zoals: ademhaling, een nabijgelegen deuropening, mensen lopen voorbij, etc. We raden het dragen van een gezichtsmasker of ophangen van een transparant gelaatsscherm onder de microscoop oculairs als een voorzorgsmaatregel.
7. Draai het objectief lenzen in de koude stikstof gas omgeving van de cryo-podium en scan voor het monster op de platte koellichaam gezichtsveld. Met behulp van standaard helder veld lichtmicroscopie technieken richten zich op de grid met een lage vergroting doelstelling om het centrum te vinden en een overzicht van foto te maken. Specificaties met betrekking tot het licht microscopie lenzen gebruikt voor dit experiment zijn opgenomen in de experimentele materialen sectie. Opmerking: LN ₂ komt niet in contact met de objectief lenzen en we hebben nog een achteruitgang van afbeeldingen of schade aan de lenzen zien van het effect van koeling .
8. Focus in een hoge vergrotingsfactor op een gebied van belang en het verwerven van gegevens met helderveld, donkere veld, gepolariseerd licht of fluorescentie beeldvorming. Zorg ervoor dat de ligging van het gebied van de rente record op de lage vergroting helder veld de afbeelding voor een toekomst correlatie. Als alle bovenstaande voorzorgsmaatregelen vermeld voor het vullen van de lN ₂ worden gevolgd, dan is de positieve druk van de verdampende stikstof is voldoende om een besmetting vrije omgeving (onafhankelijk van de vochtigheid in de ruimte) te behouden voor de duur van beeldvorming.
9. Zodra u klaar bent, vervang de laad scherm door te schuiven over de bovenkant van het beeldscherm. Verwijder het beeldscherm door het vertragen van te schuiven onder het laadscherm.
10. Haal de cryo etappe van de microscoop en met pre-gekoelde pincet, transfer terug het raster om de cryo-net box. Schroef de cryo-grid box houder in cryo-grid box voor afdichting tegen de omgeving en de houder over te dragen aan een LN2 Dewar voor opslag en de toekomst beeldvorming.

4. Cryo-elektronenmicroscopie

1. Volgende standaard en gevestigde technieken, belasting van het monster rooster in een cryo-EM overdracht houder terwijl het monster temperatuur van vloeibare stikstof te allen tijde.
2. Steek de cryo-houder met het monster rooster in een Transmission Electron Microscope.
3. In een geschikte lage vergroting te bekijken (50-500x nominale vergroting), ligt het centrum van het monster net.
4. Gebruik maken van de eerder verzamelde lage vergroting cryo-LM gegevens van stap 3.7 om de relatieve oriëntatie van het centrum van het net van de koper tabs (zoals beschreven in figuur 2) te bepalen en de exacte gebieden die van belang zijn voor correlatie te identificeren.
5. Ga verder met microscoop alignment, een lage dosis cryo-EM beeldvorming en het verzamelen van gegevens.

5. Representatieve resultaten

De cryogene stadium (figuur 1a) is een effectieve manier om cryo-LM gegevens voor cryo-fluorescentie microscopie en correlatieve cryo-LM/cryo-EM analyse te verzamelen. Figuur 2 laat zien hoe de combinatie van lage en hoge vergroting cryo-LM beelden kun je bouwen referentie kaarten die u naar specifieke gebieden in de cryo-EM. De resulterende cryo-LM referentie-kaart (figuur 2b) werd gebruikt tijdens de cryo-EM data-acquisitie om de exacte regio's weergegeven in figuur 3 te vinden.

Figuur 1. Cryogene Stage. A) De lay-out van de cryogene etappe bestaat uit een cryo-grid box overdracht monteren aangegeven wet een witte pijl en een aluminium koellichaam. Grids worden overgedragen in het kader lN ₂ van de cryo-grid box en die direct op het bekijken van het koellichaam van de ruimte, zoals aangegeven door de zwarte pijl. B) Image beeltenis van de cryogene podium met het laden van het scherm. Het gat in het laad scherm is direct geplaatst over de cryo-grid box monteren en fungeert als een poort om monsters overdracht en voor het verplaatsen van monsters uit de cryo-grid box om de sample weergavegebied op het koellichaam met een pincet. C) De cryogene fase in positie onder de objectieven met het beeldscherm op zijn plaats. De speciale uitsparing aan het beeldscherm kan de objectief lenzen om gemakkelijk in de juiste positie swing, zonder het verplaatsen van de cryogene podium. Het gat in het beeldscherm uit de buurt van het monster gebied fungeert als een lN ₂ vulpoort tot lN _twee niveaus te vullen indien nodig.

Figuur 2. Navigeren in de cryo-LM voor correlatieve studies. A) lage vergroting cryo-LM uitzicht op gistcellen gehandeld op grond van een steekproef net. B) Dezelfde afbeelding in (a) bedekt met een hoge vergroting fluorescentie beeld van een gebied van belang en met een gevulde oranje markering van de veelhoek midden van het monster net. Het centrum bestaat uit een groep van vier vierkanten, drie met een extra metalen lipje en de vierde open. Voor de drie pleinen met een extra metalen lipje, twee paar delen op het tabblad over de lange en de korte bijlen vormen een asymmetrisch centrum. Deze asymmetrische centrum is te zien in de linker bovenhoek en werd gebruikt om de rotatiehoek en de handigheid van het raster tussen de cryo-LM en cryo-EM te geven. Van een lage vergroting imago vele gebieden van belang kunnen worden gemarkeerd en worden gebruikt als referentie kaart om identieke gebieden vinden in cryo-EM. C) Een vergroot fluorescentie cryo-LM beeld van het gebied van interesse in (b). HTA1-GVB, een c-terminal GVB histon marker, kan gezien worden als een groen gestippelde structuur het labelen van de locatie van de kern. D) Een cryo-EM beeld van het overeenkomstige gebied in (c). Schaal balken geven 50 micron.

Figuur 3. Correlatie van cryo-LM en cryo-EM. Twee gezichtsveld afbeeldingen van identieke gistcellen gecorreleerd met de cryo-helderveld (a, d), cryo-fluorescentie (b, e), en de cryo-EM (c, f ). Schaal balken geven 5 micron.

Discussie

Met behulp van onze cryogene podium en monstervoorbereiding technieken, correlatieve studies tussen de cryo-LM en cryo-EM vertonen verschillende voordelen ten opzichte van traditionele kamertemperatuur benaderingen, inclusief maar niet beperkt tot: een snelle fixatie ^1,2, Minder fotobleken ³, En het scannen van het monster integriteit voorafgaand aan de cryo-EM ^4,5 Of chemische fixatie / embedding ⁶. Een van de knelpunten voor cryo-EM het verzamelen van gegevens is de tijd die nodig is voor zowel de overdracht van het monster in een TEM en scannen het raster om geschikte gebieden te vinden om beeld. Door de snelle data-acquisitie cryo-LM's ⁵, Kan de tijd besteed aan het vinden van goede cellen sterk worden verminderd. Zo kunnen we besparen tijd en geld en het inperken van dit knelpunt door de pre-scan en in kaart brengen gebieden van belang in de cryo-LM.

Meer dure of complexe cryogene trappen mogen toestaan ​​dat een hogere resolutie cryo-LM beeldvorming. Echter, het podium hier verzonnen is meer dan voldoende voor vele toepassingen. Als cryo-LM beeldvorming en sample raster transfers worden uitgevoerd met de nodige voorzichtigheid, zoals beschreven in de tekst en video, kan volledig gratis imaging verontreiniging worden bereikt. Deze methode maakt het mogelijk directe correlatie van TL-en elektronenmicroscopie gegevens van dezelfde cel, organel of macromoleculaire complex verspreid op de koolstof-support of vervat in een dunne weefselsectie ⁷. Opgemerkt moet worden dat de waarde van deze cryogene stadium gaat verder dan cryo-LM/cryo-EM correlaat studies op het gebied van lichtmicroscopie als geheel. Dit cryogene fase is goed geschikt voor zowel delicate monsters en fluorofoor kleurstoffen / vlekken ⁸, Quantum Dots, of fluorescent gelabelde eiwitten ⁹ Die kunnen worden instabiel bij kamertemperatuur chemische fixatie en inbedding met glutaaraldehyde en paraformaldehyde. Als gevolg daarvan, we hopen dat deze cryogene fase zal een grotere toegang tot diegenen die geïnteresseerd zijn in de cryo-LM, die eerder zijn afgeschrikt door de kosten en onvoldoende toegang te bieden.

Problemen met Cryo-Light Microscopie

1. Voorbeeld Adsorptie: Verschillende monsters kunnen vertonen variabele adsorptie-eigenschappen van de koolstof te ondersteunen. Misschien vindt u het noodzakelijk om andere vormen van ondersteuning roosters zoals continue koolstof, koolstof-essen of formvar gecoate roosters voor sample steun te gebruiken. Bovendien, als het monster is bindend voor de koperen staven van het rooster en niet op de koolstof-oppervlak, kan het nodig zijn om de koolstof oppervlakte chemie aan te passen door het incuberen van het raster met een uitvloeier of door gloed ontladen alvorens te proeven toevoeging.

2. Stage stabiliteit: Als u vibratie merkt, is het waarschijnlijk te wijten aan het monster podium overladen met het gewicht in plaats van het borrelen van LN2. De toegevoegde gewicht van de cryogene stadium kan soms leiden tot laagfrequente trillingen te zenden aan de standaard 3-as verplaatsing microscoop podium, en een negatieve invloed hebben op beeldvorming via vervagen. Dit kan gemakkelijk worden gecorrigeerd door het ondersteunen van de microscoop reizen etappe van onderen met ofwel een instelbare mini-lift of een instelbare adapter met dual-schroef armen, zoals in de video. Beide verstelbare steunmechanismen interactie met een niet-beweegbaar deel van de reis-stadium en daarom nog steeds vergunningen X-en Y-as vertaling als nodig is voor de beeldvorming.

Materialen

Tabel van specifieke reagentia en apparatuur:

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam	Vennootschap	Catalog #	Reacties	Kosten
1 tot 22,86 cm (9 ") pie pan met schuine rand	Good Cook		De plaatselijke supermarkt	4,39 dollar
1 tot 22,86 cm (9 ") cake pan	Good Cook		De plaatselijke supermarkt	4,93 dollar
4 paar eetstokjes			De plaatselijke supermarkt	0,50 dollar
1 - Great Stuff sproeischuim	Great Stuff		Lokale hardware store	5,98 dollar
1 - 4cm x8cm x1cm blok aluminium			Lokale hardware winkel of metalen schroothoop	10,00 dollar
5 - # 10 1,91 cm (3 / 4 ") platte kop gleuf bouten w / moeren			Lokale hardware store	0,98 dollar
3 - # 4 0,95 cm (3 / 8 ") ronde sleuven bouten w / moeren			Lokale hardware store	0,98 dollar
15 - # 10 ringen			Lokale hardware store	0,98 dollar
2 - doorzichtige plastic klemborden			Lokale kantoor op te slaan	6,84 dollar
1 - Cryo-EM raster box houder	Ted Pella	160-41		N / A
1 - Cryo-EM raster box handling staaf	Ted Pella	160-46		N / A
1 - R2 / 1 essen carbon film, 400-mesh koper cryo-EM ovenrooster	SPI Supplies	4340C-XA		N / A

Experimentele materialen

1. Giststam: Hta1-GVB:: Kan (KSC-3382: Mata, ura3-52, lys2-801, ade2-101, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1, Hta1-GVB:: KanMX6 uit de Kaplan lab aan de UC Davis).
2. Cryo-Light Microscopie: Cryo-lichtmicroscopie beelden werden genomen op een Leica DM4000M weerspiegelt microscoop met een Leica DFC310 FX-CCD-camera. Bright Field, Dark Field en fluorescentie beelden werden verkregen met behulp van een HCX PL Fluotar 5x 0,15 NA lucht doelstelling, een HCX PL Fluotar 10x 0,30 NA lucht doelstelling, een PL Fluotar 50x 0,55 NA lucht doel of een NPLAN 100x 0,75 NA lucht doelstelling. Bright Field en Dark Field afbeeldingen gebruikt een 12V 100W lamp wolfraam als lichtbron. Voor fluorescentie, was een EL6000 UV-lamp bron gebruikt in combinatie met een Leica JC1 (Ex.F.: BP 480/30, DM: LP 505, SF BP 535/40 & LP 580) Filter Cube.
3. Cryo-Transmissie Elektronen Microscopie: Cryo-EM beelden werden verkregen op een JEM-2100-FEG Transmission Electron Microscope (JEOL, Japan) werkend op 200 KeV gebruik te maken van een Gatan 626 cryo-transfer houder (Gatan, USA). Micrografen werden opgenomen tegen de nominale vergrotingen van 50, 200, 1.200 en 4.000 X op een 4096 x 4096 pixel Tietz CCD camera (TVIPS, Gauting, Duitsland).