Eiwit Membraan Overlay Test: een protocol om interactie tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten Test In vitro</em

Samenvatting

Het testen van eiwit-eiwit interacties is onmisbaar voor dissectie van eiwitten functionaliteit. Hier introduceren we een In vitro Eiwit-eiwit binding assay aan een membraan-geïmmobiliseerde eiwit probe met een oplosbare proteïne. Deze test geeft een betrouwbare methode om de interactie tussen een onoplosbaar eiwit en een eiwit in oplossing te testen.

Samenvatting

Valideren van interacties tussen verschillende eiwitten is van vitaal belang voor het onderzoek van hun biologische functies op het moleculaire niveau. Er zijn verschillende methoden, zowel in vitro als in vivo, de eiwitbinding te evalueren, en ten minste twee methoden die de tekortkomingen van elkaar aan te vullen moeten worden uitgevoerd om betrouwbare inzichten te verkrijgen.

Voor een in-vivo assay, de bimoleculaire fluorescentie invulling (BiFC) test de meest populaire en minst ingrijpende aanpak die in staat stelt om eiwit-eiwit interacties te detecteren binnen levende cellen vertegenwoordigt, evenals identificeren van de intracellulaire lokalisatie van de interagerende eiwitten ^1,2. In deze test, niet-fluorescerende N-en C-terminale helften van GFP of zijn varianten gefuseerd met getest eiwitten, en wanneer de twee fusie-eiwitten bij elkaar worden gebracht als gevolg van de geteste eiwitten 'interacties, is het fluorescerende signaal gereconstitueerde ^3-6 . Omdat het signaal is makkelijk te detecteren door epifluorescentie of confocale microscopie, heeft BiFC ontpopt als een krachtig instrument van keuze tussen celbiologen voor het bestuderen van over eiwit-eiwit interacties in levende cellen ^3. Deze test kan echter soms leiden tot valse positieve resultaten. Bijvoorbeeld, kan het fluorescerende signaal worden opgelost door twee GFP fragmenten voor zover geregeld 7 nm van elkaar als gevolg van nauwe verpakken in een kleine subcellulaire compartiment, in plaats van dat als gevolg van specifieke interacties ^7.

Als gevolg van deze beperkingen, moeten de resultaten van live-cell imaging-technologieën worden bevestigd door een onafhankelijke aanpak op basis van een ander principe voor het detecteren van eiwit interacties. Co-immunoprecipitatie (Co-IP) of glutathion transferase (GST) pull-down assays vertegenwoordigen dergelijke alternatieve methoden die vaak worden gebruikt om eiwit-eiwit interacties in vitro te analyseren. Echter IIn deze onderzoeken moet echter de geteste eiwitten worden gemakkelijk oplosbaar zijn in de buffer die supportsused voor de binding reactie. Daarom kan specifieke interacties met betrekking tot een onoplosbaar eiwit niet worden beoordeeld door deze technieken.

Hier, illustreren we het protocol voor het eiwit membraan overlay bindingstest, die dit probleem omzeilt. In deze techniek kan de interactie tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten betrouwbaar getest worden omdat een van de eiwitten is geïmmobiliseerd op een membraan matrix. Deze methode, in combinatie met de in vivo experimenten, zoals BiFC, biedt een betrouwbare benadering te onderzoeken en trouw karakteriseren interacties tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten. In dit artikel, binding tussen Tobacco mosaic virus (TMV) beweging eiwit (MP), die meerdere functies uitoefent bij virale cel-cel transport ^8-14, en een recent geïdentificeerde plant cellulaire interactor, tabak ankyrin herhaal-bevattende proteïne (ANK ) ^15, wordt aangetoond met behulp van deze techniek.

Protocol

1. Expressie en extractie van de eiwitten

1. Differentieel tag de eiwitten te testen op hun detectie. Label het eiwit te worden geïmmobiliseerd op het membraan (ProIM) met een tag van een groter formaat (bijvoorbeeld GST), en de niet-gefuseerde tag kan gebruikt worden als een geïmmobiliseerde negatieve controle (ProIMnc). Label het eiwit te gebruiken als een oplosbaar sonde (ProSol) met ofwel een grote of een kleine tag. Zekering van dezelfde tag om een ​​passende negatieve controle oplosbare proteïne (ProSOLnc) en omvatten in de interactie test om de specificiteit van de gedetecteerde binding te bevestigen.
2. Kies de eiwitexpressie systeem gemerkte eiwitten te drukken, dat wil zeggen, E. coli, baculovirus, etc., afhankelijk van de behoefte van potentiële post-translationele modificaties en de opbrengsten van de eiwitten.
3. Extract ProIM en ProIM _nc uit het organisme van de keuze (stap 1.2) met behulp van SDS-PAGE laadbuffer (20% glycerol, 4% SDS, 20 mM Tris-HCl, pH6.8) met proteïnase inhibitor cocktail. Laat de celsuspensie bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten, voeg 0,5% van de 2-mercaptoethanol en kook gedurende 5 minuten.
4. Extract ProSol en ProSol _nc uit het organisme van de keuze (stap 1.2) met behulp van een standaard protocollen ^16. Deze eiwitten moet gemakkelijk oplosbaar zijn in de bindende buffer (140 mM NaCl, 10 mM, Tris-HCl pH 7,4, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 1% BSA, 0,1% Tween 20) wordt gebruikt in de stap 4.1.
5. Bepaal de concentratie van de recombinante eiwitten met behulp van een standaard-methode, zoals Bio-Rad eiwit assay kit. zoals de Bio-Rad eiwit assay kit. Als ruw extract, in plaats van gezuiverd eiwit, wordt gebruikt voor de test, een schatting van de concentratie van het eiwit van belang in dit extract door het scannen densitometrie van de desbetreffende band op een SDS-polyacrylamide gel gekleurd met Coomassie Brilliant Blue R-250 en het gebruik van bekende concentraties van BSA als referentie.

2. Immobilisatie van ProIM en ProIMnc op het membraan

1. Resolve twee sets van extracten, die elk 1 ug van ProIM en ProIM _nc op een SDS-polyacrylamide gel volgens het standaard protocol ^16.
2. Na elektroforese, plaatst u de overdracht van de gel in 100 ml van de overdracht buffer (60 mM glycine, 10 mM Tris, 0,0006% SDS, 20% MeOH) en incubeer onder zacht schudden gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
3. Electroforetisch de eiwitten in de gel naar een nitrocellulose membraan volgens het standaard protocol ^16.

3. Re-vouwen van membraan-gebonden eiwitten

1. Na Electroforetisch, incubeer het membraan gedurende 15 minuten in 15 ml buffer A (30 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,05% Tween 20) zacht schudden om de resterende SDS te verwijderen.
2. Na het aftappen zorgvuldig, overdracht van de membraan tot 25 ml van denaturatie buffer (7 M guanidinehydrochloride, 2 mM EDTA, 50 mM DTT, 50 mM Tris-HCl pH 8,3). en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden. (Opmerking: De nitrocellulose membraan ondoorzichtig wordt bij incubatie in de denaturatie buffer). en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
3. Overdracht van het membraan tot 25 ml van de TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4) en incubeer onder zacht schudden gedurende 5 min (Opmerking: Tijdens deze stap, het membraan herwint zijn oorspronkelijke witte kleur).
4. Overdracht van het membraan tot 25 ml van bindende buffer (zie stap 1.2) en incuberen bij 4 ° C onder zacht schudden voor overnachting.

4. Onderzoek naar de ProIM door ProSol

1. Snijd de membraan in twee stroken, zowel met ProIM en ProIM _nc.
2. Maak de ProSol en ProSOLnc hybridisatie oplossingen door verdunning van de voorbereiding met 1-10 ug van zowel ProSol of ProSOLnc in 10 ml vers bindingsbuffer. Overdracht elk membraan in de ProSol of ProSOLnc hybridisatie-oplossing en incubeer gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
3. Haal de membranen van de hybridisatie-oplossingen en spoel drie keer voor 15 minuten elk in TBS.

5. Visualiseren van eiwit-eiwit interacties door immunoblotting

1. Blokkeer de membraan met 2,5% afgeroomde melk in TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Verdun het primaire antilichaam (anti-strepII polyklonaal konijn antilichaam) in 0,5% afgeroomde melk in TBST op de concentratie aanbevolen door de fabrikant.
2. Plaats de geblokkeerde membranen in het antilichaam oplossing, en geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C onder zacht schudden.
3. Spoel de membranen in 20 ml TBST gedurende 15 minuten, en tweemaal gedurende 5 min bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
4. Verdun de secundaire antilichaam (anti-konijn IgG antilichaam) geconjugeerd met mierikswortel peroxidase (HRP) in 0,5% afgeroomde melk in TBST op de concentratie aanbevolen door de fabrikant. Plaats de membranen in het secundaire antilichaamoplossing en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
5. Spoel de membranen in 20 ml TBST gedurende 15 minuten, en tweemaal gedurende 5 min bij kamertemperatuur onder zacht schudden. Na de laatste spoeling in TBS, visualiseren van de eiwit-eiwit interacties met behulp van een chemiluminescentie HRP substraat (bijvoorbeeld, Millipore Immobilon westerse chemiluminescent HRP-substraat).
6. Probe dezelfde membranen met het primaire antilichaam voor de tag gefuseerd met ProIM, gevolgd door de juiste secundaire antilichaam zoals beschreven in stappen 5,1 tot 5,4. Visualiseer ProIM en ProIMnc zoals beschreven in stap 5.5 om de identiteit van de bands die in het eiwit-membraan overlay test (stap 5.5) te valideren. In de meeste gevallen, strippen is niet nodig, omdat het signaal verkregen door deze stap is veel sterker dan de resterende signaal dat wordt verkregen uit stap 5.5.

6. Representatieve resultaten:

De ANK-MP interactie werd waargenomen door BiFC in tabak epidermale cellen (Figuur 1A). Omdat de MP is een zeer slecht oplosbaar eiwit, uitgedrukt in bacteriën of in planten, werd het eiwit membraan overlay test aangenomen om deze interactie in vitro (figuur 1B) te valideren. Eiwitextracten met 1 ug van het GST-MP (ProIM) of niet-gefuseerde GST (ProIM _nc) werden opgelost door SDS-polyacrylamide gel elektroforese, gevolgd door Electroforetisch naar een nitrocellulose membraan. Wanneer deze ProIMs waren gemerkt met oplosbare ANK-strepII (ProSol), GST-MP, maar niet ongefuseerde GST, tentoongesteld binding (Figuur 1B, lanen 1, 2, te vergelijken met lanen 5, 6). Bovendien, als dezelfde van ProIMs waren gemerkt met een niet-verwante ProSOLnc, dat wil zeggen, Arabidopsis cytoplasmatische NADH kinase getagd strepII (NADH3-strepII), geen binding werd niet waargenomen, hetgeen opnieuw aantoont de specificiteit van de ANK-MP interactie (figuur 1B, lanen 3, 4).

Figuur 1. Specifieke binding van tabak ANK aan TMV MP in vivo en in vitro. (A) ANK-MP interactie in levende tabak epidermale cellen zoals gedetecteerd door BiFC. Sterk YFP signaal werd gereconstrueerd toen MP en ANK, gefuseerd met C-terminale en N-terminale helft van YFP, werden respectievelijk coexpressed in tabak epidermis na microbombardment van hun coderende genen. Dit BiFC signaal opgebouwd in puncta bij de cel periferie, die diagnose van plasmodesmata ^15. (B) ANK-MP interactie in vitro zoals gedetecteerd door proteïne membraan overlay test. Eiwitextracten met 1 ug van het GST-MP (ProIM) of niet-gefuseerde GST (ProIMnc) werden opgelost op een 15% SDS-polyacrylamide gel, gevolgd door Electroforetisch op een nitrocellulose membraan. De GST-MPProIM en GSTProIMnc werden geïncubeerd met 0,5 ug / ml van ANK-strepII (ProSol), en ANK binding werd gedetecteerd door het sonderen van de membraan met anti-strepII konijn polyklonaal antilichaam, gevolgd door anti-konijn IgG + M secundair antilichaam geconjugeerd aan HRP (lanen 1 en 2). Noch GST-MPProIM noch GSTProIMnc interactie met een niet-verwante eiwitten, Arabidopsis cytoplasmatische NADH kinase, gefuseerd aan de strepII tag (ProSOLnc, lanen 3 en 4). De identiteit van de band waargenomen in deze test werd bevestigd door het sonderen van de membraan met anti-GST antilichaam (lanen 5 en 6). Wanneer het membraan werd behandeld met denaturatie buffer zonder gewassen met buffer A, is de binding van het GST-MP naar ANK verloren, terwijl de niet-geïdentificeerde eiwitten in het GST-MP en GST contining eiwitextracten reageerde met ANK-strepII, waaruit het belang van de stap 3.1 voor de denaturatie-proces (lanen 7 en 8).

Discussie

Deze aanpak is geschikt voor het testen van eiwit-eiwit interacties tussen combinaties van de eiwitten, wanneer ten minste een van de eiwitten is goed oplosbaar in de bindende buffer, en met succes werd toegepast op andere combinatie van eiwitten ^17,18. De iInteractions tussen de eiwitten die zowel onoplosbare onder deze omstandigheden niet kunnen worden getest door dit protocol.

Ook succesvolle hervouwing van ProIM is van cruciaal belang voor de test. Het spoelen van de membraan ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer
Eiwit testkit	Bio-Rad	500-0001
Proteïnase-inhibitor cocktail	SIGMA	S8820
Mini-veranderend systeem	Bio-RAD	165-8000
Semi-droge western blotting SD Electroforetisch systeem	Bio-RAD	170-3940
Anti-konijn IgG antilichaam geconjugeerd met mierikswortelperoxidase	GenScript	A00098
Anti-GST konijn polyklonaal antilichaam	GenScript	A00097
Anti-strepII	GenScript	A00626
BioTrace, NT nitrocellulose transfermembraan	Pall Wetenschappelijke	27377-000
Immobilon westerse chemiluminescent HRP substraat	Millipore	WBKL S0 050