Een buis formatie test wordt gebruikt om de vasculaire activiteit van tumorcellen te evalueren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een Matrigel-Based Tube Formation Assay aan de vasculogene activiteit van tumorcellen beoordelen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In de afgelopen decennia, een buis formatie test met behulp van groeifactor-gereduceerde Matrigel is meestal gebruikt om de angiogene activiteit van de vasculaire endotheliale cellen aan te tonen in vitro 1-5. Heeft echter recent steeds meer bewijzen zien dat deze test niet beperkt tot de vasculaire endotheliale cellen gedrag voor te testen. In plaats daarvan, maar ook is gebruikt om het vermogen van een aantal tumorcellen aan een vasculaire fenotype 6-8 ontwikkelen, testen. Deze mogelijkheid is in overeenstemming met hun vasculogene het gedrag die in xenotransplanted dieren, een proces dat bekend staat als vasculogene mimicry (VM) 9. Er is een veelheid aan bewijsmateriaal waaruit blijkt dat de tumor cel-gemedieerde VM speelt een vitale rol in de ontwikkeling van tumoren, onafhankelijk van de endotheelcellen angiogenese 6, 10-13. Zo werden de tumorcellen gevonden om deel te nemen in het bloed geperfuseerde, vasculaire kanaal formatie in weefselmonsters van melanoom en glioblastoma patiënten 8, 10, 11. Hier beschreven we deze buisvormige netwerk assay als een nuttig instrument bij de evaluatie van de vasculogene activiteit van de tumorcellen. We ontdekten dat sommige tumor cellijnen zoals melanoom B16F1 cellen, glioblastoma U87 cellen, en borstkanker MDA-MB-435-cellen zijn in staat om vasculaire tubuli vormen, maar sommige niet zoals de dikke darm kanker HCT116 cellen. Bovendien is dit vasculaire fenotype is afhankelijk van aantal cellen uitgeplaat op de Matrigel. Daarom kan deze test dienen als krachtig hulpmiddel om de vasculaire potentieel van een groot aantal celtypen met inbegrip van vasculaire cellen, tumorcellen en andere cellen scherm.
Protocol
1. Een Matrigel-Based Tube Formation Assay aan de vasculogene activiteit van tumorcellen beoordelen
- Voorbereiding van de tumorcellen en microvasculaire endotheelcellen: hersentumor cellen zoals U87-cellen, melanoomcellen B16F1, borstkanker MDA-MB-435, en dikke darm cellen HCT116 werden gekweekt in DMEM aangevuld met 10% FBS en penicilline / streptomycine (alle van Invitrogen ). Endotheel cellijn menselijke microvasculaire endotheelcellen (HMVECs) werden gekweekt in EBM2 medium (Lonza), aangevuld met 1 ug / ml hydrocortison en 1 ng / ml epidermale groeifactor, 10% FBS en penicilline / streptomycine. De cellen werden gewassen met PBS drie keer en vrijstaande met 0,05% trypsine / EDTA (Invitrogen). Na het centrifugeren met 2000 rpm gedurende 5 minuten werden celpellets opnieuw gewassen met PBS. Vervolgens werden de cellen gepelleteerd geteld met een hemocytometer.
- Matrigel voorbereiding: Een deel van de groei factor-gereduceerd Matrigel (BD Bioscience) werd opgewarmd bij kamertemperatuur. Voor volledig gesmolten is, werd het overgebracht naar ijs en de vloeistof werd bewaard op ijs gedurende ten minste 10 minuten. Dan 50 ul van Matrigel werd uitgeplaat op 96-well platen op een horizontaal niveau die het mogelijk maakt de Matrigel gelijkmatig te verdelen, en geïncubeerd gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Tube formatie: Cells (1-2 x 10 4) werden opnieuw gesuspendeerd met serum-vrij DMEM voor tumor cellen of EBM-2 voor endotheliale cellen, en geladen op de top van de Matrigel. Als deze test werd gebruikt voor het meten van effecten van een aantal agenten op de tubulus ontwikkeling, werden deze middelen (stimulators of remmers) toegevoegd aan de serum-vrij medium. Elke voorwaardelijke groep bevatte 4-6 putten.
- Beeld-en data-analyse: Na incubatie bij 37 ° C gedurende de nacht, elk putje werd direct geanalyseerd onder een microscoop. Als buisjes nodig waren voor de fixatie, werd 100 ul van 10% formaline zout-gebaseerde oplossing voorzichtig toegevoegd en tien minuten later, was hij klaar voor analyse. Onder een microscoop met 10x fasecontrast, werden tubuli in elk veld afgebeeld en een gemiddelde van buisjes 3-5 willekeurige velden in elk putje werd geteld.
2. Representatieve resultaten:
HMVECs werden gebruikt als een positieve controle, omdat deze buisjes werden ontwikkeld van heldere langgerekte cellichamen die verbinding maken met polygoon netwerk te vormen. B16F1, U87, en MDA-MB-435 cellen ontwikkelde vasculaire tubuli vergelijkbaar met die gevormd wordt door HMVECs, maar HCT116 cellen niet (figuur 1). Een cel dosis-afhankelijke buis formatie werd getest in U87 cellen. Zoals aangetoond in figuur 2, 10.000 cellen gevormd gestaakt tubuli. Nadat de cellen werden verdubbeld, een solide vasculaire netwerk is vergelijkbaar met die bij HMVECs. In tegenstelling tot cellen die minder dan 5000 niet in geslaagd een vasculaire fenotype vormen.
Figuur 1. Tube vorming veroorzaakt door HMVECs, U87, MDA-MB-435, en B16F1 cellen, maar niet HCT116 cellen. Alle cellen (2 x 10 4) werden geladen op Matrigel en geïncubeerd gedurende de nacht. Buisjes werden afgebeeld met behulp van fase-contrast. HMVECs werden gebruikt als een positieve controle. Een vertegenwoordiger van 3-5 velden werd getoond. Bar: 100 urn.
Figuur 2. U87 cell-geïnduceerde tubuli in een cel nummer-afhankelijke manier. Verschillende nummers van U87-cellen, zoals aangegeven in de hoeken werden gebruikt voor de vorming buis. HMVECs werden gebruikt voor een positieve controle. Bar: 100 mm.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Om deze test te slagen, moet de kwaliteit van Matrigel eerst worden getest. Een klein monster kan worden verkregen bij BD bio-vooraf-run de test met behulp van HMVECs. Andere partij producten kunnen verschillend kwaliteiten waarin sommige percelen niet voorzien in een optimale conditie voor buis vorming. Ten tweede moet elke luchtbellen worden vermeden wanneer een portie van Matrigel wordt geladen in 96-well platen, omdat de bubbels kan tubuli vorming verstoren. Als kleine belletjes zijn te vinden in een goed, kan de Ma...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door NCI R01 CA120659 (RS).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het serum | Vennootschap | Catalogus nummer | |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| Groeifactor-gereduceerde Matrigel | BD Bioscience | 47743-720 | |
| EBM2 kit | Lonza | CC-3156 | |
| Nikon ECLIPSE TS100 microscoop | Nikon |
Referenties
- Shao, R., Guo, X. Human microvascular endothelial cells immortalized with human telomerase catalytic protein: a model for the study of in vitro angiogenesis. Biochemical & Biophysical Research Communications. 321, 788-794 (2004).
- Ribeiro, M. J. Hemostatic properties of the SV-40 transfected human microvascular endothelial cell line (HMEC-1). A representative in vitro model for microvascular endothelium. Thromb Res. 79, 153-1561 (1995).
- Ades, E. W. HMEC-1: establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. J Invest Dermatol. 99, 683-690 (1992).
- Shao, R. Acquired expression of periostin by human breast cancers promotes tumor angiogenesis through up-regulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression. Molecular & Cellular Biology. 24, 3992-4003 (2004).
- Shao, R. YKL-40, a secreted glycoprotein, promotes tumor angiogenesis. Oncogene. 28, 4456-4468 (2009).
- Basu, G. D. A novel role for cyclooxygenase-2 in regulating vascular channel formation by human breast cancer cells. Breast Cancer Research. 8, R69-R69 (2006).
- Scavelli, C. Vasculogenic mimicry by bone marrow macrophages in patients with multiple myeloma. Oncogene. 27, 663-674 (2008).
- El Hallani, S. A new alternative mechanism in glioblastoma vascularization: tubular vasculogenic mimicry. Brain. 133, 973-982 (2010).
- Maniotis, A. J. Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic mimicry. American Journal of Pathology. 155, 739-752 (1999).
- Hendrix, M. J., Seftor, E. A., Hess, A. R., Seftor, R. E. Vasculogenic mimicry and tumour-cell plasticity: lessons from melanoma. Nature Reviews Cancer. 3, 411-421 (2003).
- Folberg, R. Tumor cell plasticity in uveal melanoma: microenvironment directed dampening of the invasive and metastatic genotype and phenotype accompanies the generation of vasculogenic mimicry patterns. American Journal of Pathology. 169, 1376-1389 (2006).
- Liu, C. Prostate-specific membrane antigen directed selective thrombotic infarction of tumors. Cancer Research. 62, 5470-5475 (2002).
- Sood, A. K. The clinical significance of tumor cell-lined vasculature in ovarian carcinoma: implications for anti-vasculogenic therapy. Cancer Biology & Therapy. 1, 661-664 (2002).
- Shirakawa, K. Hemodynamics in vasculogenic mimicry and angiogenesis of inflammatory breast cancer xenograft. Cancer Research. 62, 560-566 (2002).
- Ruf, W. Differential role of tissue factor pathway inhibitors 1 and 2 in melanoma vasculogenic mimicry. Cancer Research. 63, 5381-5389 (2003).
- Seftor, R. E. Cooperative interactions of laminin 5 gamma2 chain, matrix metalloproteinase-2, and membrane type-1-matrix/metalloproteinase are required for mimicry of embryonic vasculogenesis by aggressive melanoma. Cancer Research. 61, 6322-6327 (2001).
- Shirakawa, K. Vasculogenic mimicry and pseudo-comedo formation in breast cancer. International Journal of Cancer. 99, 821-828 (2002).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
