Alle procedures met diermodellen zijn beoordeeld door het lokale institutionele dierverzorgingscomité en het JoVE veterinaire reviewbord.
1. Kweek van Malassezia onder laboratoriumomstandigheden
OPMERKING: Bewaar alle reagentia en media die voor dit protocol worden gebruikt bij kamertemperatuur (RT, 20 – 25 °C), tenzij anders vermeld, omdat een lagere temperatuur de schimmelgroei kan remmen.
- Bereid het vloeibare gemodificeerde Dixon (mDixon) medium voor de groei van Malassezia voor. Om 500 ml vloeibaar mDixon-medium te bereiden, lost u 18 g maltextract, 10 g ontwaterde Ox-bile, 5 ml Tween-40, 3 g pepton, 1 ml glycerol en 1 ml oliezuur op in 500 ml gedistilleerd H2O (dH2O). Pas het medium aan naar pH 6 met HCl en autoclaveer. Bewaar het medium bij RT.
- Bereid mDixon-agarplaten voor door 7,5 g agar toe te voegen aan 500 ml mDixon-medium vóór het autoclaven. Koel de mDixon-agar langzaam af na het autoclaven met behulp van een roerbaar en een magnetische verwarmingsplaat om gedeeltelijke stolling van het medium tijdens het afkoelen te voorkomen.
- Zodra de agar is afgekoeld tot 50 – 60 °C, verdeel de vloeistof in platte petrischalen in een laminaire stroomkast en laat ze een nacht bij kamertemperatuur drogen.
OPMERKING: De agarplaten kunnen worden bewaard bij 4 °C gedurende enkele weken wanneer ze zijn ingepakt en ondersteboven worden bewaard om verdamping te voorkomen.
- Verkrijg Malassezia isolaten en breng gelyofiliseerd Malassezia materiaal nieuw leven in volgens de instructies van de leverancier.
- Inoculeer 10 ml vloeibaar mDixon-medium in een steriele 100 ml Erlenmeyerkolf met de nieuw leven ingebrachte Malassezia suspensie volgens de instructies van de leverancier. Bewaar de cultuur in een schuddende incubator bij 30 °C en 180 rpm.
- Inspecteer de groei van de Malassezia cultuur regelmatig door te controleren op de verschijning van crèmekleur en troebelheid. Groeikinetiek hangt af van de soort en stam van Malassezia en kan bijzonder langzaam zijn wanneer Malassezia vers nieuw leven is ingebracht uit een gelyofiliseerd materiaal. (Figuur 1A).
- Bereid glycerolvoorraden voor door 3 delen van de dicht gegroeide Malassezia cultuur in mDixon-medium te mengen met 1 deel steriele 99% glycerol. Verdeel de Malassezia / glycerol-mixture in steriele schroefdopbuisjes en bewaar bij -80 °C.
- Voor in vitro-propagatie, plaats Malassezia uit de vloeistofcultuur in mDixon of uit de bevroren glycerolvoorraad op een mDixon-agarplaat (bij kamertemperatuur gebracht vanaf 4 °C) met behulp van een inoculatielus.
OPMERKING: Breng mDixon-agarplaten van 4 °C naar kamertemperatuur voor gebruik, omdat koude mDixon-agar schimmelgroei remt.
- Incubeer de agarplaat (s) met Malassezia ondersteboven in een N (niet-schuddende) incubator bij 30 °C. Inspecteer regelmatig de groei van Malassezia kolonies.
OPMERKING: Malassezia kolonies op mDixon-agarplaten verschijnen binnen 3 - 5 dagen en zijn crèmekleurig, dof en glad met convexe verheffing (Figuur 1B).
- Bewaar Malassezia kolonies op mDixon-agarplaten bij kamertemperatuur voor ~ 2 weken. Bereid daarna een nieuwe mDixon-agarplaat voor door Malassezia van de bevroren glycerolvoorraad te strijken zoals beschreven in 1.7.
2. Bereiding van het inoculum voor experimentele Malassezia infectie van muizen
- Inoculeer 10 ml vloeibaar mDixon-medium in een steriele 100 ml Erlenmeyerkolf met 3 - 5 individuele Malassezia kolonies van een mDixon-agarplaat (zie stap 1, Figuur 1B).
- Incubeer de Malassezia cultuur gedurende ~ 48 tot 96 uur bij 30 °C en 180 rpm tot de cultuur crèmekleurig en troebel is (Figuur 1A).
OPMERKING: De tijd die nodig is voor de groei van Malassezia hangt af van de Malassezia soort en stam en de hoeveelheid schimmel die voor inoculatie wordt gebruikt.
- Breng 2 ml van de Malassezia cultuur over in een steriele 2 ml microcentrifugebuis en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 10.000 x g.
- Gooi het supernatant weg en was de pellet door het op te suspenderen in 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Centrifugeer opnieuw gedurende 1 minuut bij 10.000 x g.
- Na het wassen, suspendeer de pellet in 1 ml PBS door krachtig te pipetteren en meet de optische dichtheid van de oplossing bij 600 nm (ODA600) met behulp van een spectrofotometer. Verdun de Malassezia suspensie 20 - 50 x met PBS voor de OD-meting om ervoor te zorgen dat de lezing tussen 0,1 en 1 ligt.
OPMERKING: De dichtheid van een 3-daagse cultuur van Malassezia varieert over het algemeen tussen 15 en 30 ODA600, afhankelijk van de Malassezia soort en stam en van het aantal gistcellen dat
