$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle procedures met diermodellen zijn beoordeeld door het lokale instellingscomité voor dierverzorging en het JoVE veterinaire adviescomité.
1. Infectie
- Infecteer Anopheles stephensi muggen met Plasmodium berghei ANKA door ze 15 minuten te laten voeden met een gametocytemische muis. Houd de geïnfecteerde muggen bij een vochtigheid van 80% en 21 °C.
- Verzamel vrouwelijke muggen uit hun kooi 17 tot 22 dagen na de bloedmaaltijd. Plaats ze op ijs om ze te verdoven.
- Gebruik een pincet om drie tot vier muggen op een glazen plaatje te plaatsen dat bedekt is met een druppel koud RPMI-medium. Plaats de plaat onder een microscoop.
- Gebruik een pincet om de mug voorzichtig tussen het hoofd en het lichaam uit te rekken. Isoleer de speekselklier met behulp van een spuit en naald. Herhaal deze procedure met de resterende muggen.
- Verzamel de speekselklieren vanaf het glazen plaatje door ze op te zuigen met een glazen pipet en verzamel ze in een 1,5 mL centrifugebuis.
OPMERKING: Afhankelijk van de infectiegraden kunnen er meestal 8.000 tot 15.000 besmettelijke sporozoieten per speekselklier worden verkregen.
- Smeed de geïsoleerde speekselklieren binnen de centrifugebuis gedurende ongeveer 3 minuten met een kleine plastic stick om de sporozoieten van het speekselklierweefsel te isoleren.
- Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 1.000 x g en 4 °C om de sporozoieten van het resterende weefsel te zuiveren.
- Pipetteer het supernatant, dat de sporozoieten (SPZ) bevat, naar een nieuwe centrifugebuis en tel de gezuiverde sporozoieten in een Neubauer hemocytometer.
- Pas de concentratie van gezuiverde sporozoieten aan tot 10.000/mL door fosfaatgebufferd zoutoplossing toe te voegen.
- Injecteer in totaal 1.000 sporozoieten (0,1 mL) in de staartaders van ingefokt C57BL/6 muizen om een infectie te starten. Om de injecties te vergemakkelijken, plaats de C57BL/6 muizen in een vasthoudapparaat en dompel de staarten in warm (ongeveer 37 °C) water om de zichtbaarheid van de staartaders te bevorderen.
OPMERKING: De injectie zelf is een korte procedure die binnen een paar seconden kan worden uitgevoerd.
- Controleer dagelijks de bloedparasietgraad op bloeduitstrijkjes vanaf dag 3 na de SPZ-infectie.
- Beoordeel de muizen dagelijks met de Rapid Murine Coma and Behavior Scale (RMCBS) score, beginnend vanaf dag 5 na de sporozoieteninjectie.
- Beoordeel de muizen met magnetische resonantie beeldvorming (MRI) volgens de Rapid Murine Coma and Behavior Scale (RMCBS) score en de te beantwoorden onderzoeksvraag.