Een verscheidenheid van groeifactoren en eiwitten interageren te bewegen cellen op zich te nemen andere cel lot tijdens de ontwikkeling. Hier laten we zien het gebruik van een in-ovo voorbereiding op mogelijke interacties tussen verschillende eiwitten in de ontwikkeling te pakken door het plaatsen van kralen op E2.5 kippenembryo's.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het plaatsen van Growth Factor-Coated Kralen op Early Stage kippenembryo's
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De neurale buis drukt vele eiwitten in specifieke tijdruimtelijke patronen tijdens de ontwikkeling. Deze eiwitten is aangetoond dat ze kritisch zijn voor lot van de cel bepalen, celmigratie, en de vorming van neurale circuits. Neuronale inductie en patroonvorming te betrekken botmorfogenetische eiwit (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast groeifactor (FGF), onder anderen. In het bijzonder, het expressiepatroon van Fgf8 is in de nabijheid van de regio's uiten BMP4 en SHH. Deze uitdrukking patroon is in overeenstemming met ontwikkelingsstoornissen interacties die patronen te vergemakkelijken in de telencephalon.
Hier bieden wij een visuele demonstratie van een methode waarbij een in-ovo preparaat kan worden gebruikt om de effecten van fgfs in de vorming van de voorhersenen test. Kralen worden gecoat met eiwit en geplaatst in de zich ontwikkelende neurale buis om langdurige blootstelling te bieden. Omdat de procedure maakt gebruik van kleine, zorgvuldig geplaatste kralen, het is minimaal invasief en kunnen verschillende kralen worden geplaatst binnen een neurale buis. Bovendien is de methode zorgt voor verdere ontwikkeling, zodat embryo's kunnen worden geanalyseerd op een meer volwassen stadium veranderingen in de anatomie en in neurale patronen op te sporen. Deze eenvoudige maar nuttige protocol zorgt voor real-time beeldvorming. Het biedt een manier om ruimte en tijd beperkte wijzigingen aan endogene eiwit niveaus.
Protocol
1. Verwijder eieren van de broedmachine
Bij E2-2.5 (~ Sint-17 HH), verwijder de eieren en dienovereenkomstig bereiden. Ze kunnen worden gewerkt of onmiddellijk terug naar de incubator voor een paar uur. De eieren kunnen worden geplaatst op kamertemperatuur veilig voor meer dan een uur. Eieren kunnen uit het verblijf voor de duur van de manipulaties. Soms zijn deze kan een uur of meer.
Let op: Hoe langer ze zitten bij kamertemperatuur, hoe minder kans dat ze om te overleven.
2. Voorbereiding van de Oost-Indische inkt
- Bereid een verse oplossing van 4% Oost-Indische inkt in steriele PBS.
- Vul een 3 ml spuit met de oplossing.
- Plaats een 27 gauge, ½ inch naald op de spuit.
- Met behulp van een paar hemostats, buig de naald een hoek van 90 °.
3. Het openen van de eieren en injectie van Oost-Indische inkt
- Met behulp van een pincet, schil de band af en open het venster, vastzetten met behulp van de achterzijde van de tape op de achterkant van het ei.
- Gids in de gebogen naald totdat het ligt net onder het embryo. Het plaatsen van de naald onder de zwevende schijf zorgt ervoor dat de inkt, die giftig is voor het embryo, niet in direct contact komen.
- U moet alleen injecteren genoeg inkt om een comfortabele contrast te creëren. Dit is typisch minder dan ¼ ml.
4. Het openen van de neurale buis
- Neem een paar van fijne dissectie schaar en knip de dunne membraan dat ligt op de top, of soms rond, het embryo.
- Neem een paar van 55 tang of een wolfraam sonde en open de neurale buis van posterior naar anterior. Zorg ervoor dat de opening groot genoeg is om een kraal plaats in.
Opmerking: Afhankelijk van de leeftijd, een fijne wolfraam probe kan gebruikt worden om hetzelfde te doen.
5. Het ophalen van een gecoate heparine-acryl kraal
- Met behulp van een paar van 55 pincetten, vindt een intact kraal in de oplossing. Laat de kraal zich hechten aan de tip, langzaam sluit de tang.
- Haal de kraal uit de oplossing en breng deze over op de top van het ei.
- Zodra de kraal is uit de oplossing, zal het waarschijnlijk niet komen af totdat is geplaatst in de albumine.
6. Het plaatsen van de kraal
- Zodra de kraal is geplaatst op de top van het doelgebied, gebruik dan een wolfraam sonde om haar te leiden naar de voorhersenen of het probleem te verhelpen in de achterhersenen.
- Voeg een paar druppels PBS met behulp van een pipet 10 pi.
7. Het sluiten van het ei
- Sluit het ei met behulp van de dunne stukje tape om het venster te sluiten.
- Seal het ei volgens de prepping protocol, beschikbaar op http://jove.com/index/Details.stp?ID=306 .
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Afhankelijk van de eiwitten die je wenst te gebruiken, zijn er verschillende protocollen over hoe de kralen te bereiden. In deze experimenten maken we gebruik van heparine-acryl kralen, maar Affi-gel kralen kunnen ook gebruikt worden. We hebben gevonden dat de heparine-acryl kralen zijn makkelijker te manipuleren in de waterige omgeving van de ei-albumine. Kralen zijn gedrenkt in 5 l eiwit overnacht bij 4 ° C. Controle kralen worden geplaatst in steriel PBS tot het moment van plaatsing. Het voordeel bij het gebruik van een in-ovo voorbere...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te melden.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen | |
|---|---|---|---|---|
| Eieren | Dier | Bevrucht, E2-2,5 (~ St. 17 HH) | ||
| Incubator | Profi-I | Lyon | ||
| Indiase inkt | Instrument | Higgins | Bereid een 4% oplossing in steriele PBS. | |
| Steriele PBS | Als alternatief kan een antilichaamcocktail worden gebruikt | |||
| 1ml spuit | ||||
| 27G 1/2 naalden | Instrument | BD Biosciences | 305109 | In een hoek van 90 graden |
| Pincetten | Instrument | World Precision Instruments, Inc. | maat 55 | |
| Hemostaten | ||||
| Dissectieschaar | Instrument | World Precision Instruments, Inc. | 500086 | vannas, 8,5cm |
| Parafilm tape | om eieren af te dichten | |||
| Wolfraamsonde | Instrument | Electron Microscopy Sciences | 62091 | Instrument #24. Handvat optioneel. |
Referenties
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies. Jounal of Visualized Experiments. 8, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306 (2007).
- Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles. Neuroscience. 108, 183-206 (2001).
- Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity. Development . 133, 2905-2913 (2006).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
