Kwantificeren Cognitieve Vermindert Veroorzaakt door Cranial Radiotherapie

Samenvatting

Cognitieve stoornissen als gevolg van radiotherapeutische behandeling van hersentumoren vormen een klinisch hardnekkige aandoening die de kwaliteit van leven nadelig beïnvloedt. De mogelijkheid om potentiële interventies voor het verbeteren van stralingsgeïnduceerde cognitieve achteruitgang kritisch te evalueren, hangt uiteindelijk af van het vermogen om rigoureuze kwantitatieve beoordelingen van de cognitie uit te voeren.

Samenvatting

Met uitzondering van overleving is cognitieve beperking als gevolg van de klinische behandeling van kanker een belangrijke factor die het therapeutische resultaat bepaalt. Voor veel patiënten die lijden aan maligniteiten van het centraal zenuwstelsel (CZS) en niet-CZS-maligniteiten bieden radiotherapie en chemotherapie de beste opties voor ziektebeheersing. Deze behandelingen gaan echter gepaard met kosten, en bijna alle kankeroverlevers (~11 miljoen alleen al in de VS in 2006) lopen enig risico op het ontwikkelen van cognitieve disfunctie, waarbij de ernstigste gevallen worden aangetroffen bij patiënten die zijn onderworpen aan craniële radiotherapie (~200.000/jaar) voor de beheersing van primaire en metastatische hersentumoren¹. Vooral pediatrische gevallen zijn problematisch, waarbij langetermijnoverleving die gepaard gaat met duidelijke cognitieve achteruitgang leidt tot aanzienlijke sociaaleconomische lasten². Tot op heden zijn er nog geen bevredigende oplossingen voor dit belangrijke klinische probleem.

We hebben dit ernstige gezondheidsprobleem aangepakt door getransplanteerde stamcellen te gebruiken om stralingsgeïnduceerde cognitieve achteruitgang te bestrijden bij athymische ratten die zijn blootgesteld aan craniale bestraling³. Details over de stereotactische bestraling en de in vitro kweek en transplantatie van menselijke neurale stamcellen (hNSCs) zijn terug te vinden in ons begeleidende artikel (Acharya et al., JoVE referentie). Na de bestraling en de transplantatiechirurgie worden de ratten 1 en 4 maanden na de bestraling beoordeeld op veranderingen in de cognitie, de overleving van de gegrafts cellen en de expressie van differentiatiespecifieke markers. Om het succes of falen van een eventuele interventie die is ontworpen om stralingsgeïnduceerde cognitieve sequelae te verlichten kritisch te evalueren, moet een rigoureuze reeks kwantitatieve cognitieve taken worden uitgevoerd. Hiervoor onderwerpen we onze dieren aan een reeks cognitieve testparadigma's, waaronder novel place recognition, de waterdoolhof, de elevated plus maze en angstconditionering, om hippocampaal en niet-hippocampaal leren en geheugen te kwantificeren. We hebben het nut van deze tests aangetoond voor het kwantificeren van specifieke typen cognitieve tekorten bij bestraalde dieren en hebben ze gebruikt om aan te tonen dat dieren waarin hNSCs zijn ingebracht, significante verbeteringen in de cognitieve functie vertonen³.

De cognitieve voordelen die voortvloeien uit het transplanteren van menselijke stamcellen suggereren dat soortgelijke strategieën in de toekomst een broodnodig klinisch middel kunnen bieden aan kankeroverlevers die lijden aan cognitieve beperkingen. Hiertoe hebben we geschreven en visuele documentatie verstrekt van de kritieke stappen die zijn gebruikt in onze cognitieve testparadigma's om de vertaling van onze veelbelovende resultaten naar de klinische praktijk te faciliteren.

Protocol

Onze cognitieve testparadigma's zijn schematisch weergegeven in Figuur 1. De cognitieve tests worden gestart één maand na de bestraling en het uitvoeren van de chirurgische procedures.

Uitvoeren van de Novel Place Recognition (NPR)-taak

1. De Novel Place Recognition (NPR)-taak is gebaseerd op procedures beschreven door Mumby en collega's (2002) en is een taak voor ruimtelijke herkenningsgeheugreis die afhankelijk is van de hippocampus⁴.
2. Ratten worden eerst vertrouwd gemaakt met de testcontext door hen gedurende drie dagen, één keer per dag gedurende 20 minuten, in de testarena's te plaatsen (op maat gemaakte, witte, acryl, open bovenkant dozen, 70cm X 70cm X 40cm hoog). Objecten die niet voor latere tests worden gebruikt, worden tijdens deze habituatiesessies in de arena's geplaatst.
3. Voor de habituatiefase moeten handmatige observaties van het exploratiegedrag worden genoteerd, terwijl registratie en tracking van het gedrag niet noodzakelijk zijn.
4. Voor alle fasen van de NPR-taak worden de arena's tussen de dieren grondig gereinigd met 70% ethanol om storende geurimpulsen te minimaliseren. Bij alle proeven plaatsen experimentatoren de dieren in het midden van de testarena's in een consistente oriëntatie om de kans te verkleinen dat dieren simpelweg het blok verkennen dat toevallig naast hen is geplaatst.
5. De familiarisatiefase en de testfase van 5 minuten worden op de vierde dag uitgevoerd.
6. Voor de familiarisatiefase worden twee identieke plastic blokken (8cm X 3cm X 10cm hoog), die grondig zijn gereinigd met 70% ethanol, op specifieke posities binnen de testarena's geplaatst. Eén dier wordt gedurende 5 minuten in elke arena geplaatst en mag vrij verkennen.
7. De exploratie van de twee gelijkmatig bekende ruimtelijke posities wordt gescoord met behulp van het geautomatiseerde trackingsysteem. Voor alle fasen wordt exploratie gedefinieerd als de neuspunt van een dier die zich binnen een straal van 4cm bevindt en is gericht op de blokken.
8. Na de familiarisatiefase worden de dieren voor een vertragingsinterval van 5 minuten in een kleine kooi geplaatst. Gedurende deze tijd worden de testarena's gereinigd met 70% ethanol en worden identieke kopieën van de blokken toegevoegd: één op een identieke ruimtelijke positie als tijdens de familiarisatiefase en één op een nieuwe ruimtelijke positie. Als een rat de ruimtelijke schikking van de blokken uit de familiarisatiefase onthoudt, zal hij meer tijd besteden aan het verkennen van het blok op de nieuwe ruimtelijke locatie.
9. Na het vertragingsinterval van 5 minuten keren de dieren terug naar de testarena's voor de testfase van 5 minuten. Zij verkennen vrij gedurende 3 minuten.
10. 24 uur na het einde van de familiarisatiefase keren de dieren opnieuw terug naar de testarena's voor de 24-uurs testfase. Voor deze fase blijft één blok in dezelfde positie als tijdens de familiarisatie- en 5-minuten testfasen, en wordt het andere blok op een nieuwe, onbekende ruimtelijke positie geplaatst. Opnieuw geldt dat als een rat de ruimtelijke schikking van de blokken van de familiarisatiefase van de dag ervoor onthoudt, hij meer tijd zal besteden aan het verkennen van het blok op de nieuwe ruimtelijke locatie.
11. Nu wordt de hoeveelheid tijd die wordt besteed aan het verkennen van de blokken in de verschillende ruimtelijke posities verzameld met behulp van het geautomatiseerde trackingprogramma, wat statistisch geanalyseerd kan worden op verschillen tussen experimentele groepen.
12. Voor de familiarisatiefase wordt de totale tijd berekend die aan het verkennen van beide ruimtelijke locaties gedurende de gehele proef is besteed. Er mag geen verschil zijn in de tijd die aan het verkennen van de twee ruimtelijke locaties wordt besteed tijdens deze fase, aangezien deze voor de dieren gelijkmatig bekend/onbekend zijn (Fig. 2A). Bovendien kunnen significante verschillen in totale exploratie tussen de experimentele groepen wijzen op groepsvariaties in exploratiemotivatie of angstniveaus en moeten deze worden meegewogen bij de interpretatie van de resultaten van het ruimtelijke herkenningsgeheugen uit de twee testfasen.
13. Voor zowel de testfasen van 5 minuten als 24 uur wordt een exploratieratio als volgt berekend: tijd besteed aan verkennen nieuwe positie - tijd besteed aan verkennen bekende positie / totale tijd besteed aan verkennen (Fig. 2B). Op deze manier wordt rekening gehouden met individuele variabiliteit in de motivatie om de objecten te verkennen. Normale dieren besteden na de vertragingsintervallen van 5 minuten en 24 uur significant meer tijd aan het verkennen van de nieuwe ruimtelijke positie dan op basis van toeval verwacht zou worden (aangegeven door de stippellijn) (Fig. 2B).
14. De exploratieratio wordt doorgaans berekend voor de eerste 60 seconden van de 5-minuten en 24-uurs tests⁴. Dit komt doordat de nieuwe ruimtelijke positie naarmate de testproeven vorderen bekender wordt voor de dieren. De eerste minuut van de testproeven biedt daarom de meest nauwkeurige beoordeling van het ruimtelijke herkenningsgeheugen.

2. Het uitvoeren van de Elevated Plus Maze (EPM) taak

1. De Elevated Plus Maze (EPM)-taak is gebaseerd op procedures van Walf en Frye, 2007⁵.
2. De EPM-taak wordt gebruikt om angst bij knaagdieren te beoordelen. Het EPM-apparaat is een labyrint met 4 armen (45" X 4") dat 45" boven vloerniveau is geplaatst, waarbij de armen in een plusteken-vorm zijn gerangschikt. Twee armen zijn afgesloten en twee zijn open. Het getoonde apparaat is vervaardigd door Med Associates Inc.
3. Het gedrag tijdens deze taak weerspiegelt een conflict tussen de natuurlijke motivatie van de rat om nieuwe omgevingen te verkennen (tijd doorgebracht in open armen) en de voorkeur om in beschermde gebieden te blijven (gesloten armen).
4. De experimentele ruimte is helder verlicht met spotlights gericht op het labyrint om een adequate motivatie te waarborgen om de voorkeur te geven aan de gesloten, minder verlichte armen.
5. Het labyrint wordt grondig gereinigd vóór het testen van het eerste dier en tussen elke testbeurt.
6. Het dier wordt in het apparaat geplaatst door het onder de voorpoten vast te houden en in het centrale gedeelte van het labyrint te plaatsen, gericht naar de open arm die van de experimentator afgekeerd is. Elke testbeurt duurt 5 minuten.
7. Het pad van het dier wordt gevolgd met behulp van geautomatiseerde trackingsoftware, zodat het aantal betredingen en de hoeveelheid tijd doorgebracht in de open en gesloten armen kan worden berekend. Aanvullende gedragingen zoals oprijzen, poetsen en head dips over de zijkant van het apparaat kunnen worden gemonitord. Een betreding wordt geteld wanneer het middelpunt van het dier een arm binnengaat.
8. Als een rat van het labyrint valt, wordt deze snel teruggeplaatst op de open arm waarvan hij is gevallen, en wordt de gebeurtenis genoteerd in het observatielogboek. Als een rat gedurende een langere periode verstijft (freeze), worden dit gedrag en eventuele mogelijke oorzaken (bijv. plotseling hard geluid buiten de testruimte) genoteerd, en wordt het testen voortgezet zodat alle experimentele dieren vergelijkbare expositietijden hebben.
9. De tijd doorgebracht in de open versus de gesloten armen wordt gebruikt om de ratio te berekenen: tijd in open armen / totale tijd in armen. Op dezelfde manier wordt de ratio van betredingen van de open armen ten opzichte van het totaal aantal armbetredingen berekend. Met behulp van de geautomatiseerde trackingsoftware kunnen ook de totale afgelegde afstand en de snelheid worden gemeten om eventuele verschillen in motorische functie tussen experimentele groepen te beoordelen.
10. Verminderde angst is geassocieerd met een groter aandeel tijd doorgebracht in de open armen, terwijl verhoogde angst en vrees geassocieerd zijn met meer tijd doorgebracht in de gesloten armen. Normale dieren brengen significant minder tijd door in de open armen dan op basis van toeval verwacht zou worden (aangegeven door de stippellijn, Fig. 3). Angstiger dieren zullen proportioneel minder tijd in de open armen doorbrengen, terwijl minder angstige dieren meer tijd in de open armen zullen doorbrengen (bijvoorbeeld na meerdere blootstellingen aan het labyrint of na een anxiolytische drugbehandeling).

3. Uitvoeren van de contextuele en gecuede angstconditioneringstaak (FC)

1. De beschrijvingen van de contextuele en signal-gestuurde angstconditionering (FC)-taken zijn gebaseerd op procedures van Schafe et al., 1999, Winocur et al., 2006 en MacLeod et al., 2007^6-8.
2. De angstconditioneringstaak (FC) is een gedragsparadigma waarin dieren leren een voorheen neutrale stimulus (een context, een licht of een toon; de geconditioneerde stimulus) te vrezen door deze te koppelen aan een schadelijke stimulus (meestal een milde voetshock; de ongeconditioneerde stimulus). Het leren is snel, robuust en langdurig, waardoor de FC-taak vaak wordt gebruikt om de neurobiologische circuits van leren en geheugen bij knaagdieren te bestuderen.
3. Het FC-apparaat is een gesloten kamer van 30cm X 30cm X 40cm hoog (Phenotyper, Model 3000, Noldus Information Technology). De bodem van de kamer bestaat uit een rooster van roestvrij staal dat wordt gebruikt om de shockstimulus toe te dienen. De Phenotyper is uitgerust met een luidspreker die op verzoek een toon van 2300Hz en 90dB uitzendt, wat fungeert als de geconditioneerde stimulus.
4. De shock wordt toegediend via een shockgenerator (Med Associates Inc.). De shock is een kortstondig ongemak dat geen blijvende pijn of weefselschade veroorzaakt. Voor zowel de trainings- als de testproeven wordt de toediening van de shock- en toonstimuli automatisch getimed en aangestuurd met de Ethovision XT add-on Trial and Hardware Control Module (versie 7.0; Noldus Information Technology).
5. Op de eerste dag vindt de FC-training plaats. De Phenotyper wordt grondig gereinigd met 70% ethanol en een enkel dier wordt in de kamer geplaatst. De trainingsproef bestaat uit drie fasen: (1) een basisfase, waarin geen shock of toon wordt toegediend, (2) een trainingsfase, waarin toon-shockkoppelingen worden gepresenteerd, en (3) een post-trainingsfase, waarin geen shock of toon wordt toegediend. Elke fase duurt ongeveer 5 minuten, voor een totale trainingstijd van 15 minuten per dier.
6. Gedurende de trainingsfase wordt de toon 30 seconden toegediend en gelijktijdig met het einde van de toon wordt een shock van 1mA gedurende 1 seconde via het rooster toegediend. Deze toon-shockkoppeling wordt in totaal 5 keer herhaald, met een variabel interval van 10 tot 60 seconden tussen elke koppeling.
7. Gedurende de trainingsfase wordt het percentage tijd dat elk dier bewegingloos doorbrengt, of 'freezing', gemeten over de laatste 60 seconden van de initiële basisfase (om spontane freezing voor de toon-shockkoppelingen vast te stellen) en over de laatste 60 seconden van de post-trainingsfase (om freezinggedrag als reactie op de toon-shockkoppelingen vast te stellen). Normale dieren vertonen zeer lage niveaus van freezing tijdens de basisfase en zeer hoge (~95%) niveaus van freezing tijdens de post-trainingsfase (Fig. 4).
8. 24 uur later wordt het dier teruggeplaatst in dezelfde context en geobserveerd tijdens de 5 minuten durende contextuele FC-test. Tijdens deze fase wordt geen shock of toon toegediend, en het percentage tijd besteed aan freezing wordt berekend voor de gehele proef. Let op het belang van het constant houden van de context van training tot context-test. Het is zelfs noodzakelijk dat dezelfde experimentator de dieren op beide dagen hanteert en test. Normale dieren besteden ongeveer 70% van de contextproef aan freezinggedrag (Fig. 4).
9. De signal-gestuurde FC-test wordt een uur later uitgevoerd. De context van de kamer wordt gewijzigd door het rooster van de bodem te verwijderen, panelen aan de buitenkant van de kamer toe te voegen en de bodem te reinigen met een geurend huishoudelijk schoonmaakmiddel. Het freezinggedrag van het dier wordt geobserveerd gedurende de eerste minuut; de freezingniveaus zijn zeer laag als de context voldoende is gewijzigd (Fig. 4). De toon wordt vervolgens 3 minuten afgespeeld, gevolgd door een laatste minuut stilte, waarna het percentage tijd besteed aan freezing wordt berekend. Normale dieren vertonen hoge niveaus van freezing tijdens deze periode (Fig. 4).
10. In totaal worden 5 afzonderlijke maten van freezinggedrag verzameld: (1) baseline; (2) post-training; (3) context-test; (4) pre-cue test; (5) cue- en post-cue test.
11. De afwezigheid van freezing tijdens de basisfase bevestigt normale angstniveaus, terwijl aanzienlijke freezing tijdens de post-trainingsfase wijst op intacte sensorisch-motorische vermogens. Freezing tijdens de context-test bevestigt het 24-uursgeheugen voor de trainingscontext, wat afhangt van een intacte functie van de hippocampus en amygdala⁹. Een gebrek aan freezing tijdens de pre-cue test suggereert een voldoende wijziging van de initiële trainingscontext. Cue- en post-cue freezing bevestigt het 24-uursgeheugen voor de toonstimulus, wat afhangt van een intacte functie van de amygdala⁹.

4. Uitvoeren van de Morris Water Maze (MWM) taak

1. De procedures voor de Morris Water Maze-taak zijn gebaseerd op eerdere beschrijvingen^10,11.
2. De Morris water maze (MWM)-taak is een test voor ruimtelijk leren bij knaagdieren waarbij het gebruik van distale cues vereist is om een ondergelopen ontsnappingsplatform te lokaliseren in een grote bak met ondoorzichtig water. Grote, duidelijke visuele cues zijn geplaatst rond de bak op specifieke, constante locaties. De dieren leren deze cues te gebruiken om naar het ondergelopen platform te navigeren. Dieren worden gemonitord en uit het water gehaald als ze niet in staat zijn te zwemmen.
3. Ruimtelijk leren wordt beoordeeld over herhaalde trials en het referentiegeheugen wordt bepaald door de voorkeur voor het platformgebied te beoordelen wanneer het platform afwezig is. Reversal-trials verbeteren de detectie van ruimtelijke beperkingen en kunnen extra hersengebieden belasten, zoals de frontale cortex¹⁰.
4. De MWM-taak wordt over 8 dagen uitgevoerd en bestaat uit 4 fasen: een cued-test, een acquisitiefase, een 24-uurs probe-test en een reversal learning-test.
5. De bak is een op maat gemaakte witte polyethyleen tank, 200cm in diameter en 60cm hoog. Deze is gevuld met water tot een diepte van ongeveer 30cm en ondoorzichtig gemaakt met witte, niet-toxische verf. De watertemperatuur wordt gehandhaafd tussen 20 en 22°C (68 en 72°F). Het ontsnappingsplatform is een op maat gemaakte, transparante plastic standaard met een cirkelvormige bovenkant van 10cm diameter. Het bevindt zich ongeveer 1.5cm onder het wateroppervlak.
6. De cued-test bestaat uit 4 trials die op dag 1 worden uitgevoerd. Voor deze trials wordt een duidelijke zwart-witte vlag in het midden van het platform geplaatst, zodat de ontsnappingslocatie duidelijk is voor de dieren. Om het gebruik van ruimtelijke informatie tijdens deze fase te minimaliseren, worden de muur-cues verwijderd en worden de startlocaties en de locatie van het platform per trial gevarieerd. Deze fase helpt om sensorisch-motorische verschillen tussen experimentele groepen uit te sluiten voordat de acquisitiefase begint.
7. Voor alle fasen van de MWM-taak worden de dieren onder de voorpoten vastgehouden en voorzichtig in het water geplaatst op de aangewezen startpositie, met het gezicht naar de wand van de bak. Dieren worden getest in cohorten van 8, zodanig dat er een inter-trial interval van 8 tot 10 minuten is tussen elk van de 4 dagelijkse trials. Tijdens de inter-trial intervallen worden de dieren in verwarmingskooien gehouden om hypothermie te voorkomen.
8. Voor de cued-test is een maximale zwemtijd van 30 seconden toegestaan voor het dier om op het platform te klimmen. Als de maximale tijd wordt bereikt voordat het dier ontsnapt, begeleidt de experimentator het dier handmatig naar het platform en plaatst het erop. Het dier blijft voor een rustperiode van 20 seconden op het platform voordat het in een verwarmingskooi wordt geplaatst.
9. Voor elke cued-test trial start het dier vanaf een andere, vooraf bepaalde startlocatie aan de rand van de bak, en het platform wordt ook verplaatst naar elk van de 4 verschillende kwadrantposities.
10. De acquisitiefase begint de volgende dag en bestaat uit 4 trials per dag gedurende 5 opeenvolgende dagen. Tijdens deze fase blijft het verborgen platform op dezelfde locatie en leren de dieren ernaartoe te navigeren met behulp van de distale cues in de ruimte.
11. Opnieuw wordt het dier voor elk van de 4 trials op een ander, vooraf bepaald startpunt in de bak geplaatst. Elke dag bevinden twee van de startpunten zich links en twee van de startpunten zich rechts van het platform, in willekeurige volgorde, om de ontwikkeling van egocentrische ruimtelijke strategieën om de taak op te lossen te voorkomen.
12. De maximale zwemtijd voor elke acquisitie-trial is 60 seconden, waarna het dier door de experimentator naar het platform wordt begeleid en erop wordt geplaatst. Het dier blijft na ontsnapping 20 seconden op het platform.
13. Op dag 7, 24 uur na de laatste training-trial, wordt een probe-trial van 60 seconden uitgevoerd waarbij het platform is verwijderd. Deze fase bepaalt de voorkeur van het dier voor het kwadrant waarin het platform zich bevond en wordt gebruikt als maat voor het ruimtelijke referentiegeheugen¹⁰. Na de probe-trial wordt het platform teruggeplaatst in hetzelfde kwadrant en worden er 3 reguliere acquisitie-trials uitgevoerd.
14. Voor de reversal learning-test op dag 8 wordt het platform naar een nieuwe locatie verplaatst om het vermogen tot reversal learning te beoordelen. Het meten van de tijd die dieren besteden aan het zoeken naar het platform op de vorige locatie versus de nieuwe locatie geeft een beoordeling van perseveratie, oftewel het onvermogen om de respons op de vorige locatie te onderdrukken zodra het platform is verplaatst¹⁰. Net als bij de acquisitie- en probe-fasen worden er 4 trials van 60 seconden uitgevoerd.
15. Voor de cued-test worden de latentie om het platform te vinden en de snelheid respectievelijk gebruikt als maten voor de visuele en motorische functie. Verschillen tussen de experimentele groepen tijdens deze fase moeten worden meegewogen bij de interpretatie van de acquisitie- en geheugenresultaten, aangezien er verschillen in sensorisch-motorische functies tussen groepen kunnen bestaan.
16. Voor de acquisitiefase worden de gemiddelde latentie om het platform te vinden en/of de padlengte gebruikt als maten voor ruimtelijk leren. Bij normale dieren neemt de ontsnappingslatentie geleidelijk af over de vijf acquisitiedagen, zodanig dat de gemiddelde ontsnappingstijd op dag 5 rond de 15 tot 20 seconden ligt (Fig. 5A).
17. Voor de probe-fase worden de gemiddelde afstand tot het platform (Fig. 5B) en/of de latentie om voor het eerst de vorige locatie van het platform te bereiken (Fig. 5C) gebruikt als maten voor het ruimtelijke referentiegeheugen.
18. Voor de reversal-fase wordt het percentage tijd doorgebracht in het oude versus het nieuwe kwadrant met het platform gebruikt als maat voor perseveratie. Over de vier trials heen zou de voorkeur voor de oude platformlocatie moeten afnemen naarmate de voorkeur voor de nieuwe platformlocatie wordt vastgesteld (Fig. 5D).

5. Representatieve resultaten:

Figuur 1. Schematische weergave van onze cognitieve testparadigma's.

Figuur 2. Representatieve resultaten van controledieren bij de taak voor herkenning van een nieuwe plaats. A) De totale tijd besteed aan het exploreren van de twee ruimtelijke posities moet tijdens de familiarisatiefase ongeveer gelijk zijn. B) De exploratieratio (tijd besteed aan het exploreren van de nieuwe positie / tijd besteed aan het exploreren van beide posities) vertoont een duidelijke voorkeur voor de nieuwe ruimtelijke positie na vertragingsintervallen van 5 minuten en 24 uur. De stippellijn geeft de prestatie bij toeval aan.

Figuur 3. Representatieve resultaten van controledieren in het verhoogde plusdoolhof. Normale dieren brengen minder tijd door in de open armen dan op basis van toeval verwacht zou worden (aangegeven door de stippellijn). Angstige dieren zullen proportioneel minder tijd in de open armen doorbrengen in vergelijking met de controlegroep, terwijl herhaalde blootstelling aan het doolhof of behandeling met anxiolytica de tijd in de open armen zal verhogen.

Figuur 4. Representatieve resultaten van controledieren bij de angstconditioneringstaak. Lage niveaus van bevriezingsgedrag worden waargenomen tijdens de initiële blootstelling aan de kamer (baseline) en wanneer de context wordt gewijzigd voorafgaand aan de cue-test (pre-cue-test). In tegenstelling hiermoe besteden normale dieren het grootste deel van de periode na de training aan bevriezingsgedrag. Indien dieren de context waarin de training plaatsvond na een vertraging van 24 uur herinneren, vertonen zij bevriezingsgedrag gedurende ongeveer 70% van de 5-minuten contextproef. Op dezelfde manier vertonen dieren die de toon herinneren hoge niveaus van bevriezingsgedrag tijdens de cue- en post-cue-test.

Figuur 5. Representatieve resultaten van controledieren bij de Morris Water Maze-taak. A) De ontsnappingstijd neemt af bij progressieve training tijdens de acquisitiefase. B) en C) De gemiddelde afstand tot en de tijd tot het eerste passeren van de vorige locatie van het platform tijdens de 24-uurs probe-test worden gebruikt als maten voor het ruimtelijke referentiegeheugen. D) Reversal-leren wordt beoordeeld door de locatie van het platform op de laatste testdag te wijzigen. Gedurende de 4 trials stoppen normale dieren geleidelijk met het zoeken in het oude kwadrant en leren ze dat het platform zich op een nieuwe locatie bevindt.

Discussie

Er is een dringende behoefte aan langetermijnstrategieën die zijn ontworpen om de ontwikkeling van cognitieve dysfunctie te voorkomen, die steeds vaker voorkomt bij kankeroverlevers^12,13. Stamceltherapieën kunnen de middelen bieden om een reeks sequelae in normaal weefsel van het centraal zenuwstelsel (CZS) te verbeteren, aangezien ze de mogelijkheid bieden om cellen te vervangen die verloren zijn gegaan of beschadigd zijn door cytotoxische kankerbehandelingen¹⁴. Om de realisatie van deze inspanningen te bespoedigen, hebben we een reeks proof-of-principle-experimenten uitgevoerd die de capaciteit van craniaal gegrafts hNSCs hebben bevestigd om de cognitie functioneel te herstellen binnen het bestraalde weefselbed van het CZS³. Cruciaal voor dit streven was de mogelijkheid om betrouwbaar een reeks zorgvuldig gecontroleerde cognitieve tests op een reproduceerbare manier uit te voeren. We hebben deze kritieke procedures gedetailleerd in een poging om het translationele potentieel van stamceltherapieën in de kliniek te versnellen. Verdere overwegingen die waarschijnlijk een aanzienlijke impact hebben op de datakwaliteit worden hieronder toegelicht.

Cognitief testen vereist nauwkeurige aandacht voor detail, en het naleven van bepaalde standaardpraktijken kan helpen om artefacten te minimaliseren die de interpretatie van resultaten bemoeilijken. Het gebruik van speciale kamers voor gedragstesten, gescheiden van de verblijfskamers voor dieren en de experimentatoren, verdient de voorkeur. Het is daarnaast raadzaam om "witte ruis" te gebruiken die externe geluiden in de dierfaciliteit blokkeert, aangezien deze de dieren kunnen afleiden van de taak. Om stress bij de dieren die bestemd zijn voor cognitief testen te minimaliseren, is het belangrijk dat zij vóór de uitvoering van de taken vertrouwd raken met de experimentatoren die de gedragstesten zullen uitvoeren. In het algemeen wordt, bij het testen van vrouwtjes en mannetjes, aanbevolen om eerst de vrouwtjes te testen, omdat zij tijdens het testen geneigd zijn angstiger te zijn als er geursporen van mannetjes in de testarena's achterblijven. Bij het toedienen van een seriële batterij van taken is het belangrijk om de dieren eerst bloot te stellen aan de minst stressvolle taken (zoals EPM, NPR) en als laatste aan de meest stressvolle taken (zoals FC, MWM).