Morfologische Analyse van de Drosophila Larvale Perifere sensorische neuron dendrieten en axonen het gebruik van genetische Mozaïeken

Samenvatting

De dendritische arborization sensorische neuronen van de Drosophila Larvale perifere zenuwstelsel zijn bruikbare modellen zowel het algemene als neuron klasse-specifieke mechanismen van neuron differentiatie toe te lichten. We presenteren een praktische gids voor het genereren en analyseren van dendritische arborization neuron genetische mozaïeken.

Samenvatting

Ontwikkeling van het zenuwstelsel vereist de juiste specificatie van neuron positie en identiteit, gevolgd door nauwkeurige neuron class-specifieke dendritische ontwikkeling en axonale bedrading. Onlangs heeft de dendritische arborization (DA) sensorische neuronen van de Drosophila larven perifere zenuwstelsel (PNS) zijn geworden krachtige genetische modellen waarin zowel het algemene als klasse-specifieke mechanismen van neuron differentiatie toe te lichten. Er zijn vier belangrijke DA neuron klassen (I-IV) ^1. Ze zijn genoemd in volgorde van toenemende complexiteit dendriet prieel, en hebben klasse-specifieke verschillen in de genetische controle van hun differentiatie ^2-10. De DA sensorische systeem is een praktisch model om de moleculaire mechanismen achter de beheersing van de dendritische morfologie ^11-13 te onderzoeken omdat: 1) het kan profiteren van de krachtige genetische tools beschikbaar in de fruitvlieg, 2) de DA neuron dendriet prieel spreidt zich uit in slechts twee dimensies onder een optisch cleAR larvale cuticula waardoor het gemakkelijk is om te visualiseren met een hoge resolutie in vivo, 3) de klasse-specifieke verschillen in dendritische morfologie maakt een vergelijkende analyse te vinden belangrijke elementen regelen van de vorming van eenvoudige versus sterk vertakte dendritische bomen, en 4) dendritische prieel stereotype vormen van de verschillende DA neuronen te vergemakkelijken morfometrische statistische analyses.

DA neuron activiteit wijzigt de output van een schaal voor het voortbewegen centrale patroon generator ^14-16. De verschillende DA neuron klassen hebben verschillende zintuiglijke modaliteiten, en hun activering ontlokt verschillende gedragsreacties ^14,16-20. Verder verschillende klassen sturen axonale projecties stereotiep in de Drosophila larven centrale zenuwstelsel in het ventrale zenuw kabel (VNC) ^21. Deze projecties beëindigen met topografische voorstellingen van zowel de DA neuron sensorische modaliteit en de positie in het lichaam wand van de dendritische veld ^7,22, 23. Vandaar dat onderzoek van de DA axonale projecties kunnen worden gebruikt om de mechanismen die ten grondslag liggen aan topografische kaarten ^7,22,23, evenals de bedrading van een eenvoudige schakeling modulerende larvale motoriek ^14-17 toe te lichten.

We presenteren hier een praktische gids voor het genereren en analyseren van genetische mozaïeken ²⁴ markering DA neuronen via MARCM (Mosaic-analyse met een Repressible Cell Marker) ^1,10,25 en Flp-out ^22,26,27 technieken (samengevat in Fig. 1).

Protocol

1.Preparation van reagentia

1. Bereid Ca ^{+ +-vrij} HL3.1 zoutoplossing ^28.
   1. In mm: 70 NaCl, 5 KCl, 20 _MgCl2, 10 NaHCO _3, 5 HEPES, 115 sucrose, trehalose en 5, pH 7,2. Filter steriliseer en bewaar bij 4 ° C.
      Let op: Ca ^{+ +-vrije} oplossing voorkomt dat spiercontractie tijdens de dissectie.
2. Maak poly-L-lysine (PLL) dekglaasjes.
   1. Los 100mg PLL in 4.2ml water en vul aan 300μl porties in Eppendorf buizen en invriezen bij -20 ° C.
   2. Voor het coaten dekglaasjes, eerste dooi een aliquot, breng het aan 10 ml in DDH ₂ O en voeg 20μl van Kodak Photo-Flo, de uiteindelijke PLL concentratie 0,7 mg / ml.
   3. Dompel coverslips voor 30 minuten in de PLL-oplossing, te verwijderen en droog, daarna even afspoelen met water en droog. Tweemaal herhalen. Behandelde coverslips duren ongeveer een maand.

2. Genetische kruizen

1. To genereren MARCM klonen. Hier is een voorbeeld kruis met behulp van een pan-DA driver ^11,27:
   FRT2A x hsFLP; Gal4 ^{109 (2) 80,} UAS-mCD8:: GFP; tub-Gal80 FRT2A/SM5-TM6B
2. Voor het genereren van Flp-out klonen. Hier is een voorbeeld kruis met behulp van een klasse IV-specifieke driver ^8:
   PPK-Gal4 x yw, hsFLP, UAS-FRT-CD2, y ^{+-stop-FRT-mCD8::} GFP

3. Winnen van embryo's

1. Houden Drosophila kruisen in een collectie fles bij 25 ° C en het verzamelen van embryo's op een appelsap agarplaat ²⁹ verspreid dit met een dun laagje gist pasta ^30,31.

4. Heat shock behandeling van embryo's

1. Plaats een leeg bord in tegenstelling tot de appelsap agarplaat waarop de embryo's zijn gelegd. Afdichting rond deze twee platen met Parafilm (afb. 2).
2. Tijdens de heat shock, onderdompelen ee plaat in het waterbad en houd deze ingedrukt met behulp van een metalen gewicht.
3. Voor MARCM embryo's
   1. Verzamel embryo's voor 2h en incuberen in een 10 cm petrischaal omringd door vochtige weefsels bij 25 ° C voor een extra 2u.
      Let op: Aanpassen van de heat shock protocol verandert de frequentie waarmee klonen worden gegenereerd.
   2. Voor een kleiner aantal klonen, met als doel voor enkele geïsoleerde neuronen, onderdompelen en heat shock in het water bad voor 1 uur bij 38 ° C.
   3. Voor een groter aantal klonen, heat shock voor 45 min bij 38 ° C, weer terug bij RT 30 minuten, dan heat shock voor een extra 30 minuten.
4. Verzamel Flp-out embryo's voor 24 uur, en heat shock voor 1 uur bij 38 ° C.

5. Screening voor het klonen

1. Na de heat shock, verwijder het deksel van de waterdichte indeling en plaats de appelsap agarplaat in een 10 cm petrischaal, omringd door vochtige weefsels. Cultuur van de embryo's en de daaropvolgende larven bij 25 ° C tot dwalening 3 ^rd instar.
   Let op: kweekomstandigheden, in het bijzonder voeding, is aangetoond dat DA dendritische prieel morfologie ^32,33 veranderen. Zorg ervoor dat de groeiende larven toegang tot de gist plakken te allen tijde, te controleren en aanvullen van de gist plakken als nodig is.
2. Vanaf dit punt in het protocol verder, manipuleren larven zachtjes met insect pincet.
3. Kort en voorzichtig spoel de larven in het leidingwater, en plaats vervolgens op een agarplaat.
   Opmerking: Deze stap reduceert achtergrondgeluiden auto-fluorescentie uit voedsel of vuil op de larvale oppervlak.
4. Onderzoek de larven onder een krachtige microscoop fluorescentie dissectie. Identificeer larven met GFP-positieve neuronen / cellen in het lichaam muur.

6. In vivo beeldvorming van dendrieten

1. Plaats de larve in een depressie glijden glas met een kleine daling van 80% glycerol. Plaats een dekglaasje op dia om de larve te immobiliseren. Zorg ervoor dat er geen lucht blijft tussen de larve en de coverslip.
2. Duw de dekglaasje aan de larve rollen naar visualisatie van het neuron van belang mogelijk te maken. Het imago van de mCD8:: GFP-gelabelde dendritische prieel via confocale microscopie.

7. Larvale dissectie

Let op voordat u begint: DA neuron dendrieten degraderen snel na de start van dissectie. Ontleden elke individuele larve in minder dan 5min om goede dendriet morfologie te verzekeren.

1. Ontleden zwervende 3 ^e instar larven op een Sylgard plaat zoals eerder ³⁴ beschreven met de volgende wijzigingen:
   1. Voor de beeldvorming van DA neuron axon termini, ervoor te zorgen dat het centrale zenuwstelsel intact is en de segmentale zenuwen zijn niet gebroken. Na het openen van de larven, eerst zorgvuldig knip de tracheale verbindingen met het lichaam muur en verwijder voorzichtig de gehele darm.
   2. Als beeldvorming van de dendrieten alleen, verwijder de CNS om een ​​vlakkere montage.

8. Fixation en het blokkeren van larvale filets

1. Met de larve nog vastgemaakt aan de Sylgard plaat, fix it in 4% PFA in PBS gedurende 20 minuten bij KT op een licht draaiende shaker.
2. Verwijder de sporen van de larvale weefsels (vet lichaam, luchtpijp, etc.) na fixatie.
3. Was in PBST (PBS met 0,1% Triton X-100) 3x 10 minuten op de Sylgard plaat en shaker. Als het onderzoek axon termini, houdt u de filet op de Sylgard plaat. (Als vlekken dendrieten is het mogelijk om de larvale filets over te dragen aan een 0.5 ml buis bij deze stap ³⁴⁾
4. Blokkeer de larven voor 20 minuten bij RT in 5% normaal serum ezel (NDS) in PBST op een shaker.

9. Kleuring van larvale filets

1. Verwijder de blokkering oplossing en incubeer in het primair antilichaam (in 5% NDS / PBST) overnacht bij 4 ° C in een klein Tupperware container, omringd door vochtige weefsels.
2. Haal de buizen van 4 ° C en incubeer een extra uur bij RT.
3. Was 6x 10 minuten in PBST. Voeg de secundaire ANTIBODY (in 5% NDS / PBST), en de dekking fluorofoor ^foto-34 bleken te voorkomen.
4. Incubeer hetzij bij RT gedurende twee uur, of overnacht bij 4 ° C, gevolgd door een uur bij RT.
5. Was de larven 6x 10 minuten in PBST en ga verder met montage.

10. Montage van larven filets voor het onderzoek van de dendriet prieel

1. Mount elke larvale filet zo plat mogelijk met behulp van het ontleden van een schaar of een scalpel af te snijden van het hoofd (inclusief de mond haken), en de achterste (inclusief de siphonen) ^34.
2. Plaats de larvale filet op de dia nagelriem naar beneden, de berg in 80% glycerol, en verzegelen de zijkanten van het dekglaasje met nagellak voor een 'snelle' mount ^34.
3. Voor een permanente montage en een duidelijker beeld
   1. Plaats de ontleed larvale filet spier-kant naar beneden op een daling van PBS op een PLL dekglaasje, zal het snel houden aan de dekglaasje aan.
   2. Verwijder zoveel vloeistof als mogelijk na de montage, however niet laat het dan volledig opdrogen.
   3. Neem de dekglaasje (met aangesloten larven filet), door middel van een ethanol-reeks: 35% ethanol, gevolgd door 50%, 70%, 95%, en tot slot 2x 100% ethanol elk gedurende 10 minuten (de 2e 100% EtOH-oplossing vaak moet worden gewijzigd ) en ten slotte, was 2-3x 10 minuten in xyleen.
   4. Doe een druppel DPX inbedmiddel (Distyrene weekmakers Xyleen) op een schoon objectglas en zorgvuldig leg de dekglaasje filet-side-down op de top. Houden in het donker, en wacht een dag voor de DPX te stellen voor beeldvorming.

11. Montage van larven filets voor het onderzoek van de axon eindpunten

1. Houd de segmentale zenuwen lopen tussen de PNS en de CNS intact tijdens de dissectie, fixatie en kleuring om de tracering van de axonen van de perifere sensorische neuron cellichaam naar de VNC.
2. Mount elke filet larvale cuticula-kant naar beneden in 80% glycerol in een depressie glijden. Trace van de axonen van de DA cellichaam naar deVNC onder de confocale microscoop. Let op: PNS neuronen in elk lichaam muur segment project om de cognate segment van de VNC.

12. Representatieve resultaten:

Representatieve resultaten worden getoond in figuren 3-5. Fig. 3 toont de gehele prieel van een klasse IV da neuron, gevangen in vivo onder de confocale microscoop. Fig. 4 toont een close-up van een deel van de dendriet prieel van een immunohistochemisch label klasse III neuron dat correct is bevestigd aan de morfologie behouden. De bijbehorende inzet toont de degradatie die kan optreden na een mislukte dissectie en fixatie (beide gekleurd met anti-GFP antilichaam). Fig. 5 toont een enkele klasse IV axon eindpunt in het centraal zenuwstelsel (anti-GFP, groen), alle klasse IV termini zijn co-gekleurd met anti-CD2 (magenta).

Figuur 1 Protocol overzicht. a) dan verzamelen en hitte-shock embryo's. b) Selecteer een larve met een GFP-positieve DA neuron kloon, en vervolgens het imago van de GFP-gelabelde dendrietmorfologie prieel in de live larve. c) ontleden de larve, en dan immunohistochemisch vlekken op de filet. d) Monteer de gekleurde filet, en vervolgens het imago van de dendritische prieel en de axonale projecties van de DA neuron klonen.

Figuur 2 Opstelling van het appelsap agarplaat voor warmte-shock. Neem de plaat (witte pijl, ab), voeg een tweede petrischaal op de top (rode pijl b), en afdichting rond met Parafilm (blauwe pijl, b).

Figuur 3 in vivo beeld van de dendriet prieel van een mCD8:: GFP-gelabelde MARCM kloon (genotype als in punt 2.1) die een klasse IV (v'ada) neuron van een 3 ^e instar larve. Schaal bar is 50μm.

d/3111/3111fig4.jpg "/>
Figuur 4 mCD8:: GFP-gelabelde MARCM kloon van een klasse III neuron (ddaA) gekleurd met anti-GFP antilichaam, met een goede morfologie na succesvolle dissectie en fixatie (groen). De inzet toont dendriet degradatie (witte pijlen) die na mislukte dissectie en fixatie (magenta). Schaal bar is 25μm.

Figuur 5 De 3 ^e larvestadium larvale VNC. Een Flp-out kloon van een enkele klasse VI (VDAB) axon terminus (genotype als in 2.2) wordt gedetecteerd met behulp van anti-GFP antilichaam (groen). Anti-CD2 labels alle klasse IV termini (magenta). Schaal bar is 25μm.

Discussie

De Drosophila larven DA neuron model biedt een uitstekend genetisch systeem om mechanismen te onderzoeken die de controle neuron morfologie en circuit vorming. MARCM wordt meestal gebruikt voor de etikettering en voor het genereren van mutant DA neuron klonen. Voor MARCM we gebruik van zowel een pan-neurale (bijv. Gal4 ^C155) of DA neuron-specifieke driver. Met behulp van een pan-neuraal driver is het mogelijk om direct gebruik maken van verschillende bestanden op grote schaal beschik...

Materialen

Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogus nummer	Commentaar (optioneel)
SZX16 fluorescentie microscoop dissectie (met GFPHQ filter)	Olympus	SZX16
Live-Insect Forceps	FST	26030-10
26mm x 76mm depressie slide glas	Toshinriko Co	T8-R004
Sylgard 184 (of Silpot 184)	Dow Corning	3097358-1004
Poly-L-lysine	Sigma	P-1524	Dit product heeft bewezen het meest effectief
DPX afdekmedium	Sigma	44581
Konijn anti-GFP	Invitrogen	A-11122	Verdunning 1:500
Rat anti-CD8	Caltag	5H10	Verdunning 1:200
Muizen anti-CD2	AbD Serotec	MCA443R	Verdunning 1:700
Muizen anti-Fasciclin2	DSHB	1D4	Verdunning 1:10