RNA-expressieprofilering van specifieke hersenregio's bij muizen vereist een nauwkeurige en reproduceerbare strategie voor weefselverzameling. Hier wordt een protocol beschreven dat gebruikmaakt van zowel coronale hersensecties als microdissectie met behulp van een weefselpons. De opbrengst en kwaliteit van het totale RNA dat uit de resulterende monsters is verkregen, bevestigen het nut van de beschreven methode.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Niet-Laser Capture Microscopie Aanpak voor de Microdissection van Discrete Mouse Brain Regio's voor Totaal RNA isolatie en Downstream next-generation sequencing en Gene Expression Profiling
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Als technologische platforms bieden benaderingen zoals next-generation sequencing, microarray en qRT-PCR grote mogelijkheden voor het uitbreiden van ons begrip van de breedte van moleculaire regulatie. Nieuwere benaderingen, zoals RNA-sequencing met hoge resolutie (RNA-Seq)1, leveren nieuwe en uitgebreide informatie over weefsel- of toestandspecifieke expressie, zoals relatieve transcriptniveaus, alternatieve splicing en micro-RNA's2-4. De mogelijkheden om de RNA-Seq-methode in te zetten voor vergelijkende profilering van het volledige transcriptoom5 binnen specifieke weefsels of tussen fenotypisch verschillende groepen individuen, openen nieuwe wegen voor het ontrafelen van moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij zowel normale als abnormale fysiologische toestanden. Onlangs is profilering van het volledige transcriptoom uitgevoerd op menselijk hersenweefsel, waarbij verschillen in genexpressie zijn geïdentificeerd die geassocieerd zijn met ziekteprogressie6. Het gebruik van next-generation sequencing is echter nog niet op bredere schaal geïntegreerd in studies aan zoogdieren.
Studies naar genexpressie in muismodellen hebben met behulp van laser capture microscopy (LCM) voor monsteruitsnijding verschillende profielen binnen diverse hersenkernen gerapporteerd7,8. Hoewel LCM monstername met precisie op enkelcelniveau en specifieke hersengebieden mogelijk maakt, kunnen de relatief lage opbrengsten aan totaal RNA bij de LCM-methode belemmerend zijn voor RNA-Seq en andere profileringsmethoden in hersenweefsel van muizen, wat suboptimale stappen voor monsteramplificatie kan vereisen. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor microdissectie en extractie van totaal RNA uit specifieke hersengebieden van de muis. Weefselponsjes met een vaste diameter worden gebruikt om 13 weefsels te isoleren uit seriële coronale coupes van 750-μm van één individueel muizenbrein. De micropunch-monsters van het weefsel worden onmiddellijk ingevroren en gearchiveerd. Totaal RNA wordt uit de monsters verkregen met behulp van technologie voor isolatie van totaal RNA op basis van magnetische beads. De resulterende RNA-monsters hebben een adequate opbrengst en kwaliteit voor gebruik in downstream expressieprofilering. Deze microdissectiestrategie biedt een levensvatbaar alternatief voor bestaande strategieën voor monstername om totaal RNA uit specifieke hersengebieden te verkrijgen, wat mogelijkheden opent voor nieuwe ontdekkingen op het gebied van genexpressie.
Protocol
1. Opstelling van de bemonstering en voorbereiding
- Suppleer Earle's balanced salt solution (EBSS) met natriumbicarbonaat (0,44 g per 100 mL EBSS) en glucose (0,884 g per 100 mL EBSS)9. Behandel de EBSS met DEPC (0,1 mL per 100 mL EBSS) gedurende ten minste 12 uur bij 37 °C in een autoclaafbestendige fles of kolf met schroefdop.
- Plaats vijf Pasteurpipetten van 5 ¾" glas in een glazen bekerglas van 1000 mL, en plaats penseelen, met de haren naar boven gericht, in een glazen maatcilinder van 100 mL. Voeg voldoende DEPC-oplossing (0,1 mL per 100 mL ddH2O) toe om de pipetten en penselen respectievelijk te bedekken. Dek het bekerglas en de maatcilinder af met aluminiumfolie en incubeer gedurende ten minste 12 uur bij 37 °C.
- Verhit na de incubatie van 12 uur met DEPC alle met DEPC behandelde materialen tot een temperatuur >100 °C gedurende ten minste 15 minuten. Verwijder de EBSS en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur vóór bewaring bij 4 °C. Giet de ddH2O uit het bekerglas en de maatcilinder; blijf incuberen bij >100 °C totdat de materialen droog zijn. Verwijder ze, laat ze afkoelen tot kamertemperatuur en bewaar ze voor later gebruik.
- Behandel op de dag van het experiment alle werkoppervlakken met RNaseZap.
- Plaats de EBSS in een waterbad ingesteld op 40 °C en houd deze temperatuur constant. Om de EBSS te bufferen en te oxygeneren, wordt deze verzadigd met 95%/5% O2/CO2 door een gasslang in een RNase-vrije Pasteurpipet te plaatsen en de pipet in de EBSS te steken. Dek de opening van de EBSS-container af.
- Stel een Stoelting weefselsnijder in voor gebruik bij seriële secties van het hersenweefsel. Behandel de boven- en onderzijde van de weefselsnijder met RNaseZap. Bevestig een rechthoekig stuk Whatman #4 filterpapier aan het plexiglas oppervlak van de weefselsnijder. Bevestig een tweesnijdend scheermes aan de arm van de snijder. Zet de micrometer op nul en stel de minimale hoogte van de arm zo in dat het scheermes het filterpapier snijdt, maar niet de plexiglas plaat.
- Verzamel alle aanvullende materialen die nodig zijn voor de microdissectie, waaronder RNase-vrije celluurgschalen van 60x15 mm, Harris Uni-Core weefselponsen, 200 μL RNase-vrije micropipetpunten om te bevestigen aan de gasslang voor oxygenatie van coronale hersensecties in EBSS tijdens het ponsen van microstalen, gebogen scharen, droogijs en buisjes voor weefselverzameling. Plaats de buisjes op droogijs.
2. Verwijdering van de hersenen en coronale doorsneden
- Plaats de muis in een DecapiCone en onthoofd deze met een knaagdierguillotine. Verwijder de kop uit de DecapiCone en plaats deze op een vlak oppervlak. Snijd met een scalpel de huid langs de middellijn van de schedel open, beginnend ongeveer 3 mm caudaal ten opzichte van het neusgat. Pel de huidflappen zijwaarts terug om het cranium en de oogkassen bloot te leggen.
- Knip met een gebogen schaar beide oogzenuwen door, waardoor de verbinding met het oog wordt verbroken. Open de schedelholte door voorzichtig de occipitale en interpariëtale beenderen te breken en de dorsale pariëtale en frontale beenderen te verwijderen. Breek met een bottenknijper de neus- en traanbeenderen om de bulbi olfactorii bloot te leggen. Gebruik een gebogen schaar om de bulbi olfactorii weg te snijden van de rostrale hersenen. Verwijder de volledige hersenen met de achterhersenen intact. Plaats de hersenen in de bovenkant van een 60 x 15 mm, RNase-vrije Cellstar celkweekschaal. Verplaats deze naar het werkoppervlak voor weefselbemonstering.
- Gebruik een RNase-vrije pipet om het filterpapier van de bijbehorende weefselhakker voorzichtig te bevochtigen met EBSS. Bevochtig het hersenweefsel met EBSS.
- Verplaats de hersenen naar de weefselhakker en bepaal de juiste oriëntatie. Let op: de hersenen moeten zo worden gepositioneerd dat het ventrale oppervlak op het filterpapier rust. De middellijn (interhemisferische fissuur) moet loodrecht op het hakmes staan, en de rostrale rand van de hersenen moet tegen het mes aanliggen.
- Gebruik een met DEPC behandelde kunstpenseel om de hersenen stil te houden door zachte druk uit te oefenen op het dorsale oppervlak van de hersenen. Terwijl de hersenen worden vastgehouden, wordt de hendel van de meshouder ongeveer 4-5 cm boven het dorsale weefseloppervlak opgetild en in deze positie gehouden. Verwijder het penseel van het hersenoppervlak en stel de micrometer in op 750 μm. Laat de hendel zakken, waardoor het weefsel wordt gehakt en een coronaal segment van 750 μm ontstaat.
- Terwijl het hakmes stilstaat, wordt het weefselsegment met een rollende beweging van het kunstpenseel voorzichtig van het mesoppervlak weggeschoven. Plaats het weefselsegment onmiddellijk in de gezetteerde EBSS in de petrischaal. Een tweede onderzoeker kan beginnen met stap 3.1.
- Herhaal stap 2.5 en 2.6 totdat er seriële hersensecties zijn verkregen over het gehele rostro-caudale vlak.
3. Microdissectie van hersengebieden
- Pas de verlichting aan om ervoor te zorgen dat de belichting van het monster niet wordt belemmerd tijdens de weefselmicrodissectie. Stel de positie en stroming in van een mengsel van 95%/5% O2/CO2 om een gebufferde, zuurstofrijke omgeving voor het weefsel tijdens de microdissectie te handhaven.
- Identificeer de coronale hersendoorsnede die het interessegebied bevat. Leg de hersendoorsnede plat op de bodem van de petrischaal met behulp van een kunstpenseel. Selecteer de weefselpons met de juiste diameter op basis van Tabel 1 of andere referenties. Terwijl de coronale weefseldoorsnede met het kunstpenseel op zijn plaats wordt gehouden, wordt de snijpunt van de weefselpons boven het oppervlak van de weefseldoorsnede gebracht.
- Druk de punt van de weefselpons onder druk door de weefseldoorsnede stevig tegen de bodem van de petrischaal. Gebruik een rollende cirkelvormige beweging om ervoor te zorgen dat het interessegebied is losgekoppeld van het omringende weefsel. Til de weefselpons voorzichtig weg van de weefseldoorsnede en laat de micropunch vrij, zodat deze in het EBSS kan drijven.
- Plaats de weefselmicropunch onmiddellijk met een kunstpenseel in een op droogijs bewaarde bekerbuis die stabiel is bij -80 °C. Het weefsel moet gemakkelijk aan de zijkant van de buis hechten. Plaats de buis met het microsample terug op het droogijs.
- Herhaal stappen 3.2 - 3.4 voor elk hersengebied van belang.
4. Archivering van weefsels
- Zodra de microdissectie is voltooid, gebruikt u het VisionMate-scannersysteem om de respectieve barcodes voor elke TrakMates-buis met monsters vast te leggen. Wanneer het TrakMates-buisrek met 96 posities is gevuld, scant u het rek snel en plaatst u de weefselmonsters onmiddellijk in een vriezer van -80 °C tot aan de RNA-extractie.
5. Totale RNA-extractie
- Maak een RNase-vrije werkruimte klaar met behulp van RNaseZap. Bereid een voldoende hoeveelheid magnetische Bead Mix en Lysis/Binding Solution voor zoals beschreven in het MagMAX-96 Total RNA Isolation Protocol10.
- Haal de weefselmonsters uit de vriezer van -80 °C en plaats de buisjes direct op droogijs.
- Voeg 100 μL van de Lysis/Binding Solution toe aan een TrakMates-buisje met een monster. Bevestig een nuclease-vrije stamper ter grootte van een 0,5 ml buisje aan de pelletmixer en homogeniseer het weefsel. Overbreng het gehomogeniseerde monster met een low-retention nuclease-vrije pipetpunt naar een well op een ronde-bodem 96-well weefselkweekplaat. Voeg onmiddellijk 60 μL 100% isopropanol toe aan het monster met een low-retention nuclease-vrije pipetpunt en meng door 3-4 keer op en neer te pipetteren.
- Voeg 20 μL van de Bead Mix toe aan het monster met een low-retention nuclease-vrije pipetpunt. Meng door 3-4 keer op en neer te pipetteren.
- Herhaal stappen 5.3-5.4 voor alle weefselmonsters.
- Volg de stappen van het MagMAX-96 Total RNA Isolation Protocol vanaf III.A.2 om de totale RNA-extractie te voltooien. OPMERKING: Andere commercieel verkrijgbare kits voor totale RNA-isolatie op basis van magnetische beads zijn beschikbaar; deze zijn echter niet onderzocht in deze studie. Raadpleeg de handleidingen van de fabrikant voor de details van de totale RNA-isolatie met de betreffende producten.
- Meet de zuiverheid en concentratie van het resulterende totale RNA met een NanoDrop 3300 spectrophotometer of andere spectrophotometer/fluorometer-technologieën voor kleine volumes.
6. Representatieve resultaten:
| Hersenregio/Nucleus | Diameter weefselpons (mm) | Totaal RNA (ng/μL) | 260/280-ratio |
| Frontale cortex | 2.0 | 27.03 | 1.99 |
| Nucleus accumbens | 1.0 | 6.26 | 2.77 |
| Striatum | 1.5 | 27.94 | 2.19 |
| Gyrus cinguli | 1.5 | 29.05 | 2.07 |
| Hypothalamus - Nucleus Paraventricularis / Nucleus Suprachiasmatica (PVN/SCN) | 2.0 | 40.34 | 2.03 |
| Thalamus | 2.0 | 34.40 | 2.00 |
| Hypothalamus - dorsomediale nucleus / ventromediale nucleus (DMH/VMH) | 2.0 | 44.83 | 2.05 |
| Amygdala | 1.0 | 10.06 | 1.89 |
| Hippocampus - Ca 2/3 | 1.5 | 7.31 | 2.32 |
| Hippocampus - Ca1/Gyrus dentatus | 1.5 | 5.20 | 2.24 |
| Periaqueductale grijs | 1.0 | 48.21 | 2.02 |
| Nucleus raphe dorsalis | 1.0 | 6.56 | 2.18 |
| Formatio reticularis | 2.0 | 35.35 | 2.27 |
Tabel 1. Opsomming van gemicrodissecteerde hersengebieden van muizen met de respectievelijke optimale diameters van de weefselpons, representatieve totale RNA-opbrengst en zuiverheid. De 13 gemicrodissecteerde hersengebieden, vermeld in rostro-caudale volgorde, variëren in grootte en oriëntatie. De PVN/SCN-micropunch omvat de anteromediale paraventriculaire nucleus, delen van de periventriculaire nucleus, de sub-paraventriculaire zone en andere parvocellulaire neuronen. De thalamus-micropunch omvat anterieure thalamische nuclei die zich in hetzelfde coronale vlak bevinden als het PVN/SCN-micropunchgebied. De DMH/VMH-micropunch omvat accessoire magnocellulaire nuclei en andere parvocellulaire neuronen die zich tussen de dorsomediale nucleus en de ventromediale nucleus bevinden. Het amygdala-monster omvat zowel de centrale als de basolaterale subregio's. De RNA-opbrengst en 260/280-ratio's zijn enkelvoudige waarden verkregen uit de respectievelijke microdissectiemonsters om de metingen van elk hersengebied aan te tonen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn veel kritische stappen in dit protocol die zorgvuldige aandacht en overweging vereisen. De selectie van de juiste diameter van de weefselpons moet worden bepaald voor het verwijderen van elk respectievelijk interessegebied. Hoewel de diameters van de weefselpons die in Tabel 1 worden gepresenteerd geschikt zijn voor de verzameling van de vermelde hersengebieden, dient elke onderzoeker de weefselpons van de juiste grootte te bepalen voor een optimale verzameling van hun respectievelijke weefsels van belang. Ten tw...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen conflicten van belang gemeld.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door het Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) en het Army Research Office (ARO), toekenningsnummer W911NF-10-1-006.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Isotemp 102 waterbad | Fisher Scientific | 15-460-3Q | |
| RNase Zap | Ambion | AM9782 | |
| Laboratoriumrotator (orbitalschudder) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2314 –- 1CEQ | |
| Pelletmixer | VWR international | 47747-370 | |
| RNase-vrije stamper van 0,5 mL | VWR International | KT749521-0590 | nucleasevrij |
| Diethylpyrocarbonaat (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-50ML | |
| Tweesnijdende scheermesjes | Stoelting Co. | 51427 | |
| St–weefselsnijder voor vriessecties met handmatige micrometer | Stoelting Co. | 51425 | |
| 2/0 rond penseel’s-borstel | Princeton-kunstpenseel | 4350R | |
| Harris Uni-Core weefselpunch (0,75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Harris Uni-Core weefselpons (1,0 mm) | Ted Pella, Inc. | 15099 | |
| Harris Uni-Core weefselpons (1,5 mm) | Ted Pella, Inc. | 15075 | |
| Harris Uni-Core weefselpons (2,0 mm) | Ted Pella, Inc. | 15076 | |
| Guillotine | Braintree Scientific, Inc. | RG-100 | |
| DecapiCones | Braintree Scientific, Inc. | MDC-200 | |
| HyClone Earle’gebalanceerde zoutoplossing zonder essentiële aminozuren (EBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30029.02 | |
| 25 mL pipetten | Corning | 4489 | Nucleasevrij |
| epT.I.P.S. LoRetention Dualfilter pipetpunten, 20 — 300 μL | Eppendorf | 0030 077.636 | |
| TrakMates buisjes met schroefdop en doppen | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3741 | |
| VisionMate draadloze 2D-strijkcodereader | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3122MTX | |
| VisionMate SR 2D-strekkodereader voor enkel rek | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3115 | |
| 1-200 μL universele pipettepunten | Corning | 4864 | Nucleasevrij |
| Cellstar celkweekschalen | Greiner Bio-One | 628160 | nucleasevrij |
| Greiner Bio-One 96-wells polystyreen Cellstar weefselkweekplaat, U-bodem | USA Scientific, Inc. | 5665-0180 | nucleasevrij |
| #4 Filterpapier | Whatman, GE Healthcare | 1004 150 | |
| Siliconen peer-pipetteervulleur | Fisher Scientific | 13-681-102A | |
| NanoDrop 3300 Spectrofotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-3300 |
Referenties
- Pickrell, J. K. Understanding mechanisms underlying human gene expression variation with RNA sequencing. Nature. 464, 768-772 (2010).
- Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J. Biomed. Biotechnol. 853916, (2010).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 4, 11-13 (2010).
- Anglicheau, D., Muthukumar, T., Suthanthiran, M. MicroRNAs: small RNAs with big effects. Transplantation. 90, 105-112 (2010).
- Forrest, A. R., Carninci, P. Whole genome transcriptome analysis. RNA. Biol. 6, 107-112 (2009).
- Twine, N. A., Janitz, K., Wilkins, M. R., Janitz, M. Whole transcriptome sequencing reveals gene expression and splicing differences in brain regions affected by Alzheimer's disease. PLoS One. 6, e16266-e16266 (2011).
- Paulsen, S. J. Gene expression profiling of individual hypothalamic nuclei from single animals using laser capture microdissection and microarrays. J. Neurosci. Methods. 177, 87-93 (2009).
- Winrow, C. J. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain. Res. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N. Circadian integration of glutamatergic signals by little SAAS in novel suprachiasmatic circuits. PLoS One. 5, e12612-e12612 (2010).
- Technologies, L. MagMAX-96 Total RNA Isolation Kit Instruction Manual. , Forthcoming.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
