Methodenartikel

Niet-Laser Capture Microscopie Aanpak voor de Microdissection van Discrete Mouse Brain Regio's voor Totaal RNA isolatie en Downstream next-generation sequencing en Gene Expression Profiling

DOI:

10.3791/3125

⸱

13 november 2011

 ,  ,  , 
1Center for Sleep and Circadian Biology, Northwestern University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA-expressieprofilering van discrete muis-hersengebieden vereist een nauwkeurige en herhaalbare strategie voor weefselverzameling. Een protocol dat zowel coronaire hersseparering als door een weefselkernboor gesteunde microdissectie gebruikt, wordt hier beschreven. De opbrengst en kwaliteit van het totale RNA dat uit de resulterende monsters wordt verkregen, bevestigt de bruikbaarheid van de beschreven methode.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als technologische platforms hebben benaderingen zoals next-generation sequencing, microarray en qRT-PCR groot potentieel voor het uitbreiden van ons begrip van de breedte van moleculaire regulatie. Nieuwere benaderingen zoals hoog-resolutie RNA sequencing (RNA-Seq)1 leveren nieuwe en uitgebreide informatie over weefsel- of toestandsspecifieke expressie zoals relatieve transcriptniveaus, alternatieve splicing en micro RNA's2-4. Het gebruik van de RNA-Seq methode in comparatief gehele transcriptomen profilering5 binnen discrete weefsels of tussen fenotypisch verschillende groepen individuen biedt nieuwe wegen voor het verduidelijken van moleculaire mechanismen betrokken bij zowel normale als abnormale fysiologische toestanden. Onlangs is gehele transcriptomen profilering uitgevoerd op menselijk hersenweefsel, waarbij genexpressieverschillen geïdentificeerd zijn die geassocieerd zijn met ziekteprogressie6. Echter, het gebruik van next-generation sequencing moet nog breder geïntegreerd worden in studies met zoogdieren.

Genexpressiestudies in muismodellen hebben verschillende profielen gerapporteerd binnen verschillende hersenkernen door gebruik te maken van laser capture microscopy (LCM) voor monstersnijden7,8. Terwijl LCM monstersnijden biedt met single-cell en discrete hersengebied precisie, kunnen de relatief lage totale RNA-opbrengsten van de LCM benadering prohibitief zijn voor RNA-Seq en andere profileringsbenaderingen in muis hersenweefsels en kunnen suboptimale monstersnijdingsstappen vereisen. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor microdissectie en totale RNA extractie uit discrete muis hersengebieden. Set-diameter weefsel corers worden gebruikt om 13 weefsels te isoleren uit 750-μm seriële coronale secties van een individueel muisbrein. Weefsel micropunch monsters worden onmiddellijk bevroren en gearchiveerd. Totaal RNA wordt verkregen uit de monsters met behulp van magnetische parel-geactiveerde totale RNA isolatie technologie. De resulterende RNA-monsters hebben voldoende opbrengst en kwaliteit voor gebruik in downstream expressieprofilering. Deze microdissectie strategie biedt een levensvatbare optie voor bestaande monstersnijdingsstrategieën voor het verkrijgen van totaal RNA uit discrete hersengebieden, waardoor mogelijkheden geopend worden voor nieuwe genexpressie ontdekkingen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sampling setup en voorbereiding

  1. Supplement Earle's balanced salt solution (EBSS) met natriumbicarbonaat (0,44 g per 100 mL EBSS) en glucose (0,884 g per 100 mL EBSS)9. Behandel de EBSS met DEPC (0,1 mL per 100 mL EBSS) gedurende ten minste 12 uur bij 37 °C in een autoclaveerbare fles of flacon met schroefdop.
  2. Plaats 5 ¾" glazen Pasteur pipetten in een 1000 mL glazen beker, en plaats kunstenaarsborstels, met borstels omhoog, in een 100 mL glazen gradueercilinder. Voeg voldoende DEPC-oplossing toe (0,1 mL per 100 mL ddH2O) om de pipetten en borstels respectievelijk te bedekken. Bedek de beker en gradueercilinder met aluminiumfolie en incubeer gedurende ten minste 12 uur bij 37 °C.
  3. Na incubatie van 12 uur met DEPC, verwarm alle DEPC-behandelde materialen gedurende ten minste 15 minuten tot een temperatuur van >100 °C. Verwijder EBSS en koel af tot kamertemperatuur voor opslag bij 4 °C. Giet ddH2O weg van de beker en gradueercilinder; blijf incuberen bij >100 °C tot de materialen droog zijn. Verwijder, koel af tot kamertemperatuur en bewaar voor later gebruik.
  4. Behandel op de dag van het experiment alle werkoppervlakken met RNaseZap.
  5. Plaats en houd EBSS in een waterbad ingesteld op 40 °C. Om de EBSS te bufferen en te oxygeneren, infiltreer met 95%/5% O2/CO2 door gasslang in een RNase-vrije Pasteur pipet te plaatsen en de pipet in de EBSS te steken. Bedek de opening van de EBSS-container.
  6. Stel een Stoelting weefselsnijder op voor gebruik bij serieel snijden van hersenweefsel. Behandel de boven- en onderkant van de weefselsnijder met RNaseZap. Bevestig een rechthoekig stuk Whatman #4 filterpapier aan het plexi-glazen oppervlak van de weefselsnijder. Bevestig een dubbelzijdig scheermesje aan de snijderarm. Stel de micrometer op nul en pas de minimale hoogte van de snijderarm aan zodat het scheermesje het filterpapier kan snijden, maar niet het plexi-glasplaatje.
  7. Verzamel alle aanvullende materialen die nodig zijn voor de microdissectie, inclusief RNase-vrije 60x15 mm celkweekschotels, Harris Uni-Core weefselkerspuiten, 200 μL RNase-vrije micropipettips voor bevestiging aan gasslang voor EBSS-oxygenatie van coronale hersensecties tijdens microsample punching, gebogen schaar, droog ijs en buisjes voor weefselverzameling. Plaats de buisjes op droog ijs.

2. Hersenverwijdering en coronale sectie

  1. Plaats de muis in een DecapiCone en onthoofd met behulp van een knaagdier guillotine. Verwijder het hoofd uit de DecapiCone en plaats het op een vlakke ondergrond. Gebruik een scalpel om de huid langs de middellijn van de schedel te snijden, beginnend ongeveer 3 mm caudaal van de neus. Trek de huidflapjes lateraal terug om de schedel en de oogkassen bloot te leggen.
  2. Snij met behulp van een gebogen schaar beide optische zenuwen door hun verbinding met het oog door te snijden. Open de hersenholte door voorzichtig de occipitale en interpariëtale botten te breken en de dorsale pariëtale en frontale botten te verwijderen. Gebruik een bottang om de nasale en traanbeenderen te breken om de reukbollen bloot te leggen. Gebruik een gebogen schaar om de reukbollen van de rostrale hersenen los te snijden. Verwijder de hele hersenen met intacte hersenstammen. Plaats de hersenen in de bovenkant van een 60 x 15 mm, RNase-vrije Cellstar celkweekschotel. Breng over naar het weefselbemonsteringswerkoppervlak.
  3. Gebruik een RNase-vrije pipet om het filterpapier aan de bevestigde weefselsnijder conservatief te bevochtigen met EBSS. Bevochtig het hersenweefsel met EBSS.
  4. Breng de hersenen over naar de weefselsnijder en stel de juiste oriëntatie in. Opmerking: De hersenen moeten worden gepositioneerd met de ventrale oppervlakte op het filterpapier. De middellijn (interhemisferische spleet) moet loodrecht op het snijderblad staan en de rostrale rand van de hersenen moet tegen het blad aanliggen.
  5. Gebruik een DEPC-behandelde kunstenaarsborstel om de hersenen stationair te houden door voorzichtig druk uit te oefenen op het dorsale oppervlak van de hersenen. Terwijl de hersenen stationair worden gehouden, til de bladhouderarm omhoog tot ongeveer 4-5 cm boven het dorsale weefseloppervlak en houd deze in deze positie. Verwijder de borstel van het hersenoppervlak en draai 750 μm op de micrometer. Laat de arm zakken, snijdt het weefsel en creëert een 750 μm coronale sectie.
  6. Terwijl het snijderblad stationair blijft, gebruik een rollende beweging met de kunstenaarsborstel om de weefselsectie voorzichtig van het snijderoppervlak te vegen. Plaats de weefselsectie onmiddellijk in het geoxygeneerde EBSS in de petrischaal. Een tweede onderzoeker kan beginnen met stap 3.1.
  7. Herhaal stappen 2.5 en 2.6 totdat seriële hersensecties zijn verkregen over de volledige rostro-caudale vlak.

3. Microdissectie van hersengebied

  1. Pas de verlichting aan om ervoor te zorgen dat de monsterverlichting niet wordt belemmerd tijdens de weefselmicrodissectie. Pas de positie en stroming van het 95%/5% mengsel van O2/CO2 aan om een gebufferde, geoxygeneerde omgeving voor het weefsel te behouden tijdens microdissectie.
  2. Identificeer de coronale hersensectie die het gebied van belang bevat. Orienteer de hersensectie plat op de bodem van de petrischaal met behulp van een kunstenaarsborstel

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn veel kritieke stappen in dit protocol die zorgvuldige aandacht en overweging vereisen. De selectie van de juiste diameter van de weefselkerner moet worden bepaald voor het verwijderen van elke respectieve regio van belang. Hoewel de diameters van de weefselkerner die in Tabel 1 zijn gepresenteerd, geschikt zijn voor het verzamelen van de vermelde hersengebieden, moet elke onderzoeker de geschikte grootte van de weefselkerner bepalen voor de optimale verzameling van hun respectieve weefsel(s) van belang. Ten tweed...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten zijn verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door de Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) en het Army Research Office (ARO), toekenningsnummer W911NF-10-1-006.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Isotemp 102 water bathFisher Scientific15-460-3Q
RNase ZapAmbionAM9782
Lab rotator (orbital shaker)Thermo Fisher Scientific, Inc.2314 –- 1CEQ
Pellet mixerVWR international47747-370
RNase-vrij 0,5 mL pestelVWR internationalKT749521-0590Nuclease-vrij
Diethyl pyrocarbonaat (DEPC)Sigma-AldrichD5758-50ML
Dubbelzijdige scheermesjesStoelting Co.51427
St–lting weefselsnijder met handmatige micrometerStoelting Co.51425
2/0 Ronde kunstenaarsborstelPrinceton Art Brush4350R
Harris Uni-Core weefselkerner (0,75 mm)Ted Pella, Inc.15072
Harris Uni-Core weefselkerner (1,0 mm)Ted Pella, Inc.15099
Harris Uni-Core weefselkerner (1,5 mm)Ted Pella, Inc.15075
Harris Uni-Core weefselkerner (2,0 mm)Ted Pella, Inc.15076
GuillotineBraintree Scientific, Inc.RG-100
DecapiConesBraintree Scientific, Inc.MDC-200
HyClone Earle's gebalanceerde zout oplossing (EBSS)Thermo Fisher Scientific, Inc.SH30029.02
25 mL pipettenCorning4489Nuclease-vrij
epT.I.P.S. LoRetention Dualfilter pipet tips, 20 — 300 μLEppendorf0030 077.636
TrakMates schroefstopbuizen met doppenThermo Fisher Scientific, Inc.3741
VisionMate draadloze 2D streepjescodelezerThermo Fisher Scientific, Inc.3122MTX
VisionMate SR enkele rek 2D streepjescodelezerThermo Fisher Scientific, Inc.3115
1-200 μL universele pasvorm pipet tipsCorning4864Nuclease-vrij
Cellstar celcultuur schotelsGreiner Bio-One628160Nuclease-vrij
Greiner Bio-One 96-well polystyreen Cellstar weefselcultuurplaat, U-bodemUSA Scientific, Inc.5665-0180Nuclease-vrij
#4 FilterpapierWhatman, GE Healthcare1004 150
Siliconen bulb-type veiligheidspipetvullerFisher Scientific13-681-102A
NanoDrop 3300 SpectrofotometerThermo Fisher Scientific, Inc.ND-3300

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pickrell, J. K. Understanding mechanisms underlying human gene expression variation with RNA sequencing. Nature. 464, 768-772 (2010).
  2. Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J. Biomed. Biotechnol. 853916, (2010).
  3. Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 4, 11-13 (2010).
  4. Anglicheau, D., Muthukumar, T., Suthanthiran, M. MicroRNAs: small RNAs with big effects. Transplantation. 90, 105-112 (2010).
  5. Forrest, A. R., Carninci, P. Whole genome transcriptome analysis. RNA. Biol. 6, 107-112 (2009).
  6. Twine, N. A., Janitz, K., Wilkins, M. R., Janitz, M. Whole transcriptome sequencing reveals gene expression and splicing differences in brain regions affected by Alzheimer's disease. PLoS One. 6, e16266-e16266 (2011).
  7. Paulsen, S. J. Gene expression profiling of individual hypothalamic nuclei from single animals using laser capture microdissection and microarrays. J. Neurosci. Methods. 177, 87-93 (2009).
  8. Winrow, C. J. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain. Res. 1271, 1-17 (2009).
  9. Atkins, N. Circadian integration of glutamatergic signals by little SAAS in novel suprachiasmatic circuits. PLoS One. 5, e12612-e12612 (2010).
  10. Technologies, L. MagMAX-96 Total RNA Isolation Kit Instruction Manual. , Forthcoming.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Microdissectie van hersengebiedenweefselcorer techniekRNA vrije omgevingseri le weefselcoupesextractie met magnetische beadsbereiding van EBSS

Gerelateerde artikelen