Imaging G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR)-gemedieerde Signaling Gebeurtenissen die controle Chemotaxis van Dictyostelium discoideum</em

Samenvatting

We beschrijven hier gedetailleerde live cell imaging methoden voor onderzoek van chemotaxis. We presenteren fluorescentie microscopische methoden om spatiotemporele dynamiek van de signalering gebeurtenissen in migrerende cellen te controleren. Meting van signalering gebeurtenissen laat ons toe verder te begrijpen hoe een GPCR-signalering netwerk gradiënt sensing van chemoattractants en controles directionele migratie van eukaryote cellen bereikt.

Samenvatting

Veel eukaryote cellen kan detecteren hellingen van de chemische signalen in hun omgeving en migreren dienovereenkomstig ^1. Deze begeleide cel migratie wordt genoemd als chemotaxis, die essentieel is voor de verschillende cellen om de uitvoering van hun functies, zoals handel in immuuncellen en patroonvorming van neuronale cellen ^{2, 3.} Een grote familie van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's) detecteert variabele kleine peptiden, bekend als chemokines, naar cel migratie direct in vivo ^4. Het uiteindelijke doel van chemotaxis onderzoek is om te begrijpen hoe een GPCR machines zintuigen chemokine gradiënten en controles gebeurtenissen die leiden tot chemotaxis signalering. Daartoe hebben we beeldvormende technieken te gebruiken, in real time, spatiotemporele concentraties van chemoattractants, cel-beweging in een helling van chemoattractant, GPCR gemedieerde activering van heterotrimere G-eiwit, en intracellulaire signalisatie gebeurtenissen die betrokken zijn bij chemotaxis van eukaryote cellen ^5-8 . De eenvoudige eukaryotische organisme, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic gedragingen die vergelijkbaar zijn met die van de leukocyten, en D. discoideum is een belangrijk modelsysteem voor het bestuderen van eukaryote chemotaxis. Als vrij levende amoeben, D. discoideum cellen delen in rijk medium. Bij de honger, cellen binnen te dringen een ontwikkelingsstoornis programma waarin ze totaal door cAMP gemedieerde chemotaxis naar multicullular structuren te vormen. Veel onderdelen die betrokken zijn bij chemotaxis naar het kamp zijn geïdentificeerd in D. discoideum. De binding van cAMP aan een GPCR (car1) induceert dissociatie van heterotrimere G-eiwitten in Gγ en Gβγ subeenheden ^{7, 9, 10.} Gβγ subeenheden activeren Ras, die op hun beurt activeert PI3K, PIP ₂ omzetting in PIP ₃ op het celmembraan ^11-13. PIP ₃ dienen als bindingsplaatsen voor eiwitten met pleckstrin Homologie (PH) domeinen, waardoor werven deze eiwitten aan het membraan ^{14, 15.} Activering van car1 receptoren controleert ook het membraan verenigingen van PTEN, die PIP ₃ dephosphorylates aan PIP ₂ ^{16, 17.} De moleculaire mechanismen zijn evolutionair geconserveerd in chemokine GPCR-gemedieerde chemotaxis van menselijke cellen zoals neutrofielen ^18. Wij presenteren volgende methoden voor het bestuderen van chemotaxis van D. discoideum cellen. 1. Voorbereiding van chemotactische component cellen. 2. Imaging chemotaxis van cellen in een cAMP verloop. 3. Het bewaken van een GPCR geïnduceerde activatie van heterotrimere G-eiwit in een levende cellen. 4. Imaging chemoaantrekkende-triggered dynamische PIP ₃ antwoorden in enkele levende cellen in real time. Onze ontwikkelde beeldvormende technieken kunnen worden toegepast op chemotaxis van menselijke leukocyten te bestuderen.

Protocol

1. De voorbereiding van chemotactische competente cellen van Dictyostelium discoideum

1. Voor het genereren van D. discoideum cellen die chemotactische aan de chemoattractant cAMP-, oogst-cellen groeien in D3-T rijke media van een trillende cultuur bij 22 ° C.
2. Twee keer wassen van de cellen in de niet-voedingsstoffen ontwikkeling buffer (DB buffer met 5 mM Na ₂ HPO _4, 5 mM KH ₂ PO _4, 2 mM MgCl _2, en 0,1 mM CaCl _2).
3. Re-schorten cellen in DB buffer bij een dichtheid van 2x10 ⁷ cellen / ml.
4. Schud 10 ml cellen in een 250 ml kolf bij 100 tpm bij 22 ° C gedurende een uur.
5. Lever 100 pi van 7,5 uM cAMP voorraad hebben voor de 10 ml cellen om de zes minuten over zes uur tot een uiteindelijke concentratie van 75 nM cAMP, een proces dat aangeduid als cAMP pulserende behandeling te realiseren. Na 5-6 uur van cAMP pulserende behandeling, D. discoideum cellen worden chemotactische bevoegde in de richting van cAMP verloop.
6. Verzamel cellen door centrifugeren bij 200 g gedurende 5 minuten en daarna resuspendeer cellen met DB buffer die 2,5 mM cafeïne, en schud bij 200 tpm bij 22 ° C gedurende 20 minuten aan cel basolate naar een chemotactische situatie.

2. Imaging chemotaxing cellen in een zichtbaar en manipuleerbaar chemoattractant gradiënt

1. Backfill een micropipet met een vers bereide 30 ul oplossing van 1 uM cAMP en Alexa 594 op 0.1μg/μl in DB buffer.
2. Bevestig de Femtotip om een ​​micropipet houder en sluit de slang aan op een druk leveren apparaat, Eppendorf FemtoJet systeem.
3. Bevestig de micropipet montage aan een micromanipulator (Eppendorf TransferMan NK2) gemotoriseerde micromanipulator om een ​​constante druk te verstrekken om een ​​stabiele gradiënt vast te stellen.
4. Monteer een een-goed LabTek kamer gevuld met 6 ml van DB buffer meer dan een 40X olie lens op een confocale microscoop en gebruik van licht-field optiek, het centrum van de Femtotip in het gezichtsveld.
5. Schakel de druk van het aanbod en stel de vergoeding druk (Pc) voor 70 hPa tot een gradiënt van het cAMP / Alexa 594 mengsel vast te stellen.
6. Visualiseer cAMP gradiënt door het bewaken van het mengsel van de gewenste concentratie van cAMP en Alexa 594 fluorescentie excitatie met behulp van een 543 nm laser lijn.
7. Gebruik de auto-positionering functie van de micromanipulator om micropipet te maken aan de gewenste posities en ze in te stellen als positie 1, positie 2 en positie 3 tot en met het verloop om welke cel worden blootgesteld aan te manipuleren.

3. Immobiele ongepolariseerde cell imaging systeem vergemakkelijkt signalisatie gebeurtenissen die betrokken zijn bij cAMP gradiënt sensing

1. Na de cafeïne de behandeling, het verwijderen van een hoeveelheid van cellen en centrifugeer bij 500g gedurende 3 minuten.
2. Verwijder de buffer en verdun cellen 5x10 ⁵ cellen / ml met vers DB buffer met 2.5 mM cafeïne.
3. Breng 1 ml celsuspensie aan een single-kamer goed of 0,4 ml aan elke well van een vier-kamer goed.
4. Laat cellen om zich te houden gedurende 10 min, voorzichtig pipet uit de buffer om losse cellen te verwijderen en met hetzelfde volume te vervangen.
5. Zoek de gewenste cellen onder de microscoop en start beeldvorming.
6. Voor een experiment ontworpen om de dynamiek van signalering componenten in de cellen bloot te stellen aan een constante helling bewaken, te behandelen van de cellen met 5,0 uM (eindconcentratie) Latrunculin B gedurende 10 minuten voorafgaand aan de experimenten.

4. Gelijktijdige monitoring heterotrimere G-eiwit activering en PIP ₃ productie

1. cAMP pulserende ontwikkelen van cellen die co-expressie GαCFP en YFPGβ (G-cellen) en de cellen die PIP ₃ indicator PH-GFP (PH-cellen) ^7.
2. Vermeng deze twee soorten cellen met 1:1-verhouding en de plaat ze in een goed-of 4-kamers goed.
3. Maken en opslaan van de emissie-vingerafdruk referentiecurve CFP, GFP en YFP gebruik van Lambda Stack Overname mode binnen het spectrale bereik 464 tot 624 nm met een 10 nm breed.
4. Tegelijkertijd afbeelding G-eiwit activering in G-cellen en PIP ₃ productie in PH cellen met behulp van met dezelfde Lambda Stack Overname mode binnen het spectrale bereik 464 tot 544 nm met een 10 nm stappen.
5. Van toepassing Lineair unmixing functie van Zeiss 510META software met behulp van opgeslagen CFPand YFP en emissie-vingerafdrukken wiskundig berekenen van de bijdrage van elke fluorofoor in de Lambda Stack voor het gemeenschappelijk visserijbeleid en YFP intensiteit in afzonderlijke kanalen in G. aparte
6. Met dezelfde strategie toe te passen Lineair unmixing functie met behulp van GFP zijn opgeslagen en de achtergrond emissie vingerafdrukken wiskundig berekenen GFP-intensiteit in PH-cellen.

5. Representatieve resultaten:

1. Een uitstekend modelsysteem van D. discoideum voor GPCR gemedieerde chemotaxis. Een sociale amoebe, D. discoideum vertoont een opvallende chemotaxis gedurende de levenscyclus. Door zijn genetische en biochemische voordelen, D. d biedt een krachtige enystem naar chemotaxis te bestuderen.
2. Chemotaxis van de cellen onder een zichtbaar en manipuleerbaar chemoattract velden. Hier hebben we eerst laten zien een eenvoudige methodologie om een lineair verband tussen cAMP concentratie en de intensiteit van een fluorescente kleurstof Alexa 594 door een verdunningsreeks van 2 uM cAMP gemengd met 10 ug / ml te verkrijgen Alexa 594 (Fig. 2A). Vervolgens bieden wij een eenvoudige manier om de gradiënt bovendien visualiseren,, om een ​​kwantitatieve meting van cAMP concentratie van een gradiënt vast te stellen door de intensiteit van de Alexa 594 (Fig. Fig. 2B).
3. Celbeweeglijkheid is ontkoppeld met cel polarisatie en directionele sensing. Een actine polymerisatieremmer elimineert reeds bestaande morfologische polariteit en voorkomt ook celbeweging met behoud van de cellen 'capaciteit van directionele sensing (Fig. 3A). Werkgelegenheid van zichtbare en manipuleerbaar cAMP stimulatie garandeert de ingang, bijvoorbeeld uniforme wijze wordt toegepast stimulaties of een verloop. Deze methode laat een kwantitatieve analyse van cAMP-geïnduceerde herverdeling van belangrijke signalering componenten in het verloop sensing machines. Gemeten spatiotemporele dynamiek van deze signaleringscomponenten ons in staat stellen te begrijpen hoe het signaleringsnetwerk aanpassing bereikt om een ​​uniforme prikkels, terwijl het genereren van gepolariseerd biochemische reacties op hellingen (Fig. 3B).
4. Systemische metingen van de kinetiek van chemosensing signaleringsnetwerk bij blootstelling aan een constante helling. Het is van cruciaal belang voor de dynamiek / kinetiek meten van directionele-sensing signaleringscomponenten om te begrijpen hoe elk onderdeel bijdraagt ​​aan de totstandkoming van intracellulaire polarisatie wanneer de cellen ervaren eerste gradiënt. Toepassing van live cell imaging met een hoge tempo-ruimtelijke resolutie, hebben we eerst tonen een bifasisch PIP 3 productie van de cel die is blootgesteld aan een constante cAMP gradiënt (Fig. 4A-C). Het toepassen van live-cell imaging, hebben we systematisch gemeten dynamiek van directionele-sensing specifieke signalering netwerk van cAMP stimuleren tot de productie PIP 3 (fig. 4D, E).
5. Gelijktijdige monitoring heterotrimere G-eiwit activering en PIP ₃ productie op uniforme wijze worden toegepast cAMP stimulatie. Förster resonance energy transfer (FRET afgekort) biedt een efficiënte aanpak van heterotrimere G-eiwit activering (dissociatie) monitor bij de cAMP stimulatie. Hier beschreven we een handige easy-vast te stellen voor een gelijktijdige meting van heterotrimere G-eiwit activering en PIP ₃ productie door het toezicht op de FRET verandering en membraan translocatie van PIP ₃ sonde, PH-GFP in G en de PH-cellen, respectievelijk (Fig. 5 ). Een uniforme wijze wordt toegepast cAMP stimulatie veroorzaakt een aanhoudende G-eiwit activering, terwijl die leidt tot een voorbijgaande PIP ₃ productie.

Figuur 1: Een uitstekend modelsysteem van D. discoideum voor GPCR gemedieerde chemotaxis. A. Schema toont een korte signaalweg van directionele sensing. B. cAMP gradient induceert een snelle chemotaxis van D. discoideum cellen. Cellen brengen PIP ₃ sonde, PH-GFP (groen). Gradiënt (rood) wordt gevisualiseerd door Alexa 594. Schaalbalk = 50μm.

Figuur 2: chemotaxis van cellen onder een zichtbaar en manipuleerbaar chemoattract velden. A. grafiek toont een lineair verband tussen cAMP concentratie en de intensiteit van een fluorescente kleurstof Alexa 594 door een verdunningsreeks van 2 uM cAMP gemengd met 10 ug / mL Alexa 594. B. Kwantitatieve meting van cAMP concentratie van een gradiënt door de lineaire relatie van cAMP concentratie en de intensiteit van de fluorescente kleurstof Alexa 594 in A.

Figuur 3: Cell motiliteit is ontkoppeld met cel polarisatie en directionele sensing. A. Image blijkt dat onbeweeglijk cellen door de behandeling van actine polymerisatieremmer Latrunculin B behouden de mogelijkheid van directionele sensing. Cellen brengen PIP ₃ sonde, PH-GFP (groen). Gradiënt (rood) wordt gevisualiseerd door Alexa 594. B. manipuleerbaar cAMP stimuleren en onbeweeglijk cel systeem maakt het mogelijk aan te pakken belangrijke vragen van directionele sensing. Schaalbalk = 10μm.

Figuur 4: Systemische metingen van de kinetiek van chemosensing signaleringsnetwerk bij blootstelling aan een constante gradiënt. A. Montage vertoont een bifasische PIP ₃ productie (groen) van de cel die is blootgesteld aan een constante cAMP gradiënt (rood). B. Image geeft de regio's van de belangen (ROI) voor het meten van de kinetiek van PIP ₃ de productie die in C. C . Kinetics of PIP ₃ productie in de cellen blootgesteld aan een constante helling. D. schema toont het signaleringsnetwerk van directionele sensing van cAMP stimulatie om PIP ₃ productie. Hun kinetiek bij blootstelling aan een constante gradiënt wordt gepresenteerd in dezelfde kleur vaste lijnen in E.

Figuur 5: Gelijktijdige bewaking multi-gebeurtenissen van GPCR signalering netwerken. A. Schema toont gelijktijdige meting van heterotrimere G-eiwit activering en PIP ₃ productie door het toezicht op de FRET verandering en membraan translocatie van PIP 3 sonde, PH-GFP in G en de PH-cellen, respectievelijk. B. Montage van de regenboog beelden van G-en PH-cellen shows dat een uniforme wijze wordt toegepast cAMP stimulatie veroorzaakt een aanhoudende G-eiwit geactiveerd op de mobiele randapparatuur, terwijl die jongeren een tijdelijke PIP 3 productie. De tijdstippen zijn voor (0s) en na stimulatie voor 4.9s, 10.2s en 20.4s. C. Kinetiek van de G-eiwit activering en PIP 3 de productie op een uniforme wijze worden toegepast cAMP stimulatie.

Discussie

De processen van het bereiken van chemotactische bevoegde stadium van de cellen

Voor wild-type D. discoideum cellen, het duurt ongeveer 5 ~ 6 uur pulserende ontwikkeling bij kamertemperatuur om ze te bewegen tot een goed chemotactische bevoegde fase waarin cellen weer een goed gepolariseerd cellulaire morfologie en de snelle celmigratie (afb. 1). Verschillende factoren, zoals de cAMP concentratie voor pulserende, temperatuur, en verschillende genetische achtergronden, van invloed kunne...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties
D3-T Growth Media	KD Medische
Cafeïne	Sigma
Latrunculin B	Molecular Probes
Alexa 594	Molecular Probes
cAMP	Sigma
ChronTrol XT programmeerbare timer	ChronTrol Corp
Miniplus 3 slangenpomp	Gilbson
Platform rondschudapparaat
FemtoJet microcapillaire druk aanbod	Eppendorf
Single-en vier-en Lab-Tek II dekglaasje kamers	Nalge Nunc International
LSM 510 META of gelijkwaardig fluorescentiemicroscoop	Zeiss		een 40X 1.3 NA of 60X 1.4 NA olie DIC Plan-Neofluar objectief
Olympus x81 of gelijkwaardig	Olympus		Vereist een 100X 1,47 NA TIRF objectief