CD4 + T-lymfocyten Capture Met behulp van een Wegwerp Microfluïdische Chip voor HIV

Protocol

1. Bereid microfluïdische kanaal met anti-CD4 ⁺ biotinlayted oppervlak.
2. Injecteer 10 ml van het monster bloed op 5 ml / min in de microfluïdische kanaal met injectiepomp.
3. Spoel het bloed van 20 ml / min voor 20 min met PBS.
4. Injecteer verdunde FACS lyseren oplossing (verdund tot 10% uit voorraad oplossing met PBS) op 5ul/min gedurende 15 minuten.
5. Incubeer gedurende 15 minuten.
6. Injecteer primair CD3 ⁺ antilichaam-oplossing (verdund tot 10% uit voorraad oplossing met PBS) op 5 ml / min voor 20 minuten.
7. Incubeer 2 uur.
8. Spoel kanaal met PBS bij 5 ml / min gedurende 15 minuten.
9. Injecteer 20% AF488 CD4 ⁺ antilichaam, 0,2% DAPI stockoplossing, en 10% secundair CD3 ⁺ antilichaam op 5 ml / min gedurende 20 minuten op hetzelfde moment.
10. Incubeer gedurende 20 minuten.
11. Spoel het kanaal met PBS bij 5 ml / min gedurende 15 minuten.
12. Count cellen onder fluorescentiemicroscoop:
    1. White (optisch) - Zwart-wit: cel-en stof
    2. UV (DAPI) - Blauw: cel slechts
    3. Blauw (CD4 ⁺⁾ - Groen: T-lymfocyten en monocyten
    4. Groen (CD3 ⁺⁾ - Rood: T-lymfocyten alleen

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
PDMS-microkanaal				Gefabriceerd met SU-8 mal
Bloed				Gedoneerd bloed van een gezond menselijk subject. Mass General Hospital, 10 X hoge dichtheid WBC of Brigham and Women’s Hospital.
PBS	Buffer	Invitrogen	14190	1x Dulbecco’s gefosfateerde gebufferde zoutoplossing.
FACS-lyseeroplossing		BD Biosciences	349202	Verdund tot 10% vanuit de stamoplossing met PBS.
Anti-CD4+ biotinylatie Ab		Beckman Coulter Inc.	IM0704	Oppervlak geprepareerd met Anti-CD4+ biotinylatie Ab, verdund tot 10% vanuit de stamoplossing met PBS/BSA na menging met 0,2mg stamoplossing en 1ml gedeïoniseerd water.
geit anti-hCD3delta	pAB	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-1128	Verdund tot 10% vanuit de stamoplossing met PBS
konijn anti-geit IgG PE		Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-3755	Secundair Ab voor anti-CD3 Ab, verdund tot 10% vanuit de stamoplossing met PBS
anti-humaan CD4+		BD Biosciences	557695	Alexa Fluor 488 gelabeld, verdund tot 20% vanuit de stamoplossing met PBS.
DAPI		Invitrogen	D1306	4’,6-dianidino-2-fenylindool, dihydrochloride-oplossing, verdund tot 0,2% vanuit de stamoplossing met PBS.