Dermatitis herpetiformis (DH) is een chronische inflammatoire aandoening die wordt gekenmerkt door een auto-immune reactie tussen IgA en epidermale transglutaminase (ETG). DH ontwikkelt zich in een heel klein deel van gluten-gevoelige en / of patiënten met coeliakie. De resultaten van deze studie geven aan dat DH ook kunnen ontwikkelen in een resusaap gastheer met symptomen van idiopatic dermatitis.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Erkenning van Epidermale Transglutaminase door IgA en tissue transglutaminase 2 antilichamen in een zeldzaam geval van Rhesus Dermatitis
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is een intestinale digestief enzym dat al gedeeltelijk verteerd dieet gluten bijvoorbeeld gliadine peptiden deamidates. In aanleg gevoelige individuen, tTG2 triggers auto-immune reacties die worden gekenmerkt door de productie van tTG2 antilichamen en hun directe depositie in kleine darmwand 1,2. De aanwezigheid van dergelijke antilichamen vormt een van de belangrijkste kenmerken van de coeliakie (CD). Epidermale transglutaminase (ETG) is een ander lid van de transglutaminase familie die ook kan functioneren als een autoantigen in een kleine minderheid van de CD-patiënten. In deze relatief zeldzame gevallen, ETG triggers een auto-immuun reactie (huiduitslag) klinisch bekend als dermatitis herpetiformis (DH). Hoewel het exacte mechanisme van CD en DH pathogenese is niet goed begrepen, is het bekend dat tTG2 en ETG delen antigene epitopen die door serum antilichamen te herkennen aan zowel cd-als DH patiënten 3,4.
(Macaca mulatta) met dermatitis (tabel 1, Fig. 1 en 2) werd gebruikt om de getroffen weefsels te bestuderen. In een dier (EM96) een spectrale overlap van IgA en tTG2 antilichamen (afb. 3) werd aangetoond. De aanwezigheid van de dubbele positieve tTG2 + IgA + cellen werd geconcentreerd in de diepe epidermis, rond de dermale papillen. Dit komt overeen met letsels beschreven in DH patiënten 3. Toen EM96 werd geplaatst op een gluten-vrij dieet, de dermatitis, evenals tTG2 + IgA + deposito's verdwenen en waren niet meer aantoonbaar (afb. 1-3). Dermatitis echter verscheen, op basis van re-introductie van gluten in de voeding EM96 (niet afgebeeld). In andere makaken met inbegrip van dierlijke met niet verwante dermatitis, werden de tTG2 + IgA + deposito's niet gedetecteerd. Gluten-vrij dieet-afhankelijke vergeving van dermatitis in EM96, samen met de aanwezigheid van IgA tTG2 + + cellen in de huid suggereren een auto-immuunziekte, DH-achtigemechanisme voor de ontwikkeling van deze aandoening. Dit is het eerste verslag van de DH-achtige dermatitis in een niet-menselijke primaat.
Protocol
1. Huidbiopsie monstername
- Voorafgaand aan de huid biopsie procedure, intramusculair verdoven dieren met 2,5 mg / kg tiletamine hydrochloride en zolazepam hydrochloride telazol mengsel (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA). Toezicht op de dieren van de toediening van verdoving tot decubitus en daarna uit hun behuizing.
- Verwijder het haar van de huid van belang gebruik te maken van een Oster Golden A5 Single Speed Clipper Veterinaire met een grootte van 40 blad (Oster Professional Products, McMinnville, TN) en aseptisch bereiden met afwisselende Betadine scrub en alcohol. Secure een steriele fenestrated laken over de geselecteerde biopsie site.
- Met behulp van een steriele techniek, plaats een 4,0 mm Miltex Punch Dermal Biopsie instrument (Miltex, York, PA) tegen de huid, terwijl het draaien van de instrument 180 graden met de klok mee en tegen de klok in met een lichte druk totdat de biopsie punch transecten door de dermale lagen in het subcutane tissue. Verwijder de biopsie monster en pak de doorsneden gedeelte van de huid met een pincet en vrij van het subcutane weefsel.
- Sluit de huid defect met 3-0 nylon hechtdraad bevestigd aan een 3 / 8 cirkel snijden naald (Ethilon, Ethicon, Johnson & Johnson Medical BV, Berkshire, Verenigd Koninkrijk) in een kruisvormig patroon. Geef alle dieren 0,01 mg / kg buprenorfine-hydrochloride (Hospira, Lake Forest, IL), dat intramusculair voor postoperatieve analgesie.
2. Monster verwerking
- Werken met de huid biopsie monsters van chronische dermatitis en gezonde controle makaken rhesus. Krijgen twee tot drie (4 mm in diameter) monsters biopsie van elk dier.
- Fix eerste monster in zink formaline (Z-fix, Anatech Ltd, Battle Creek, MI) voor 24 uur, wassen in water gedurende 30 minuten, spoel kort in 70% ethanol, en breng het in ASP300 Leica weefsel processor (Leica Microsystems Inc , Buffalo Grove, KS) waarbij weefsel is uitgedroogd met oplopende gradaties van 70%, 80%, 95% en 100% ethanol 48min elk (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), gevolgd door twee veranderingen van xyleen (Fisher).
- Inbedden in paraffine media (Fisher) voor lange-termijn opslag bij kamertemperatuur. Plaats bij-20oC gedurende 20 min voorafgaand aan de snijden. Bereid 6 micrometer delen met behulp van een roterende microtoom (HM325, Microm International, Waldorf, Duitsland). Plaats secties over betalen dia's (Fisher) en de lucht droog bij 60oC 's nachts. Vlek met hematoxyline en eosine (H & E)-methode (hieronder beschreven).
- Fix tweede monster in 2% paraformaldehyde (USB Corp, Cleveland, OH) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, drie keer wassen in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA), plaats in 30% sucrose (Fisher) voor 4 uur, en in te bedden in oktober bevriezing medium (Sakura Finetek, Torrence, CA). Houden-80 ° C gedurende 20 min voorafgaand aan de snijden. Bereid 15 micrometer secties met behulp van de cryostaat (HM560, Thermo Scientific, Kalamazoo, MI).
3. H & E kleuring
- Deparaffinize insluitenDED delen door drie veranderingen van xylenen (Fisher) en rehydrateren via gesorteerd rietsuikeralcohol: drie veranderingen van 100%, twee veranderingen van 95%, een verandering van 80% en gedestilleerd water, 2 minuten elk.
- Vlek met hematoxyline (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI) voor een min en volgen door een kort wassen in stromend leidingwater.
- Tegenkleuring met eosine (Sigma) voor 6 minuten.
- Uitdrogen gekleurde weefsels door middel van 95% en absolute ethanol, twee veranderingen van 2 minuten elk en vervolgens duidelijk in drie veranderingen van xylenen, 3 minuten elk.
- Mount dekglaasje met behulp van Cytoseal Mounting Medium (Richard Allan-wetenschappelijk) over de H & E-gekleurde weefselcoupes.
4. Histopathologische beoordeling
Inspecteer de H & E-gekleurde huid biopsie secties onder een lichtmicroscoop met behulp van de 4 - 40x vergroting en Leica microscoop met een SPOT Insight digitale camera (Digital Instruments Inc, Michigan, USA).
5. Immunofluorescentie staining
- Werken met OKT-embedded skin secties voor immunofluorescentie kleuring. Voorafgaand aan de kleuring, week gedurende 20 min in PBS met 0,2% vis huid gelatine (FSG, Sigma) met 0,1% Triton X-100 (Sigma) om de LGO te verwijderen en het weefsel permeabilize.
- Na het wassen van de glaasjes, incubeer met 10% normaal geit serum (NGS, Sigma), verdund in PBS-FSG gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, in een bevochtigde slide kamer.
- Met het oog op de afzetting van IgA antilichamen en tTG2 visualiseren, incubeer dia's met anti-rhesus IgA en tTG2 primaire antilichamen, verdund in 10% NGS-PBS-FSG gedurende 1 uur.
- Wassen met PBS-FSG-Triton X-100 (Sigma) gedurende 10 min, gevolgd door PBS-FSG gedurende 10 minuten.
- Incubate met secundaire, isotype-specifieke antilichamen gelabeld met Alexa Fluor fluorchroom 488 (groen), 568 (rood) of 633 (blauw) (Molecular Probes-Invitrogen) op 1:1000 verdunning. Gebruik de Topro-3 kleurstof om de kern-DNA te visualiseren. Gebruik maken van de 10% NGS-PBS-FSG als een antilichaam verdunningsmiddel.
- Gebruik maken van de anti-quenching oplossing (Sigma) om de gekleurde weefselcoupes monteren.
6. Confocale imaging
Voer beeldvorming met een Leica TCS SP2 True confocale laser scanning microscoop (Leica, Wetzlar, Duitsland), uitgerust met drie lasers (zes lijnen voor excitatie beschikbaar): een argon-laser krypton bij 488 nm (groen), een krypton laser op 568 nm ( rood) en een helium-neon laser bij 633 nm (blauw), dat de spanwijdte van het zichtbare naar het verre-rode kant van het spectrum. Record differentieel interferentie contrast (DIC) beelden voor evaluatie van niet-gemerkte weefsel architectuur.
7. Representatieve resultaten
Een voorbeeld van positieve erkenning van de ETG door zowel tTG2 en IgA-antistoffen wordt getoond in Fig. 3A. In overeenstemming met situatie in menselijke patiënten en als gevolg van veel lagere prevalentie van DH-achtige dermatitis dan CD-achtig gluten gevoeligheid ook in de rhesus makaken, zijn de meeste van de huid biopsie monsters zullen naar verwachting show de positieve reactie met tTG2 antistoffen maar zonder de aanwezigheid van IgA tTG2 + + dubbele positieve cellen (afb. 4). Deze DH-niets gevallen, zoals dermatitis gevallen van microbiële oorsprong, zal onthullen een aantal single-positieve IgA + cellen verspreid onder de epitheel, maar niet spectrale overlap tussen de tTG2 en IgA-gelabeld markers (figuren 3B en 4). Daarom is het belangrijk om de volgorde van de voorgestelde testprocedures te onderhouden, te beginnen bij klinisch onderzoek (afb. 1), gevolgd door histopathologische evaluatie (afb. 2) en alleen als er geen andere, meer algemene dermatitis-veroorzakende stoffen kunnen worden geïdentificeerd, confocale microscopie onderzoek van huidbiopten gekleurd voor tTG2 en IgA is gerechtvaardigd. Klinische en / of histopathologische evaluaties alleen zijn niet voldoende voor een positieve diagnose van deze aandoening. In die gevallen waar dubbel-positieve (+ tTG2 IgA +) zijn geïdentificeerd in de omgeving van dermale papillen, DH-achtige dermatitis diagnose kan worden uitgegeven. In een dergelijk geval, de intrekking van dieet glutenen het beheer van gluten-vrij dieet wordt aanbevolen om de dermatitis symptomen te verlichten.
Figuur 1. Liesstreek van de EM96 makaak vóór (A) en na (B) intrekking van dieet gluten gedurende 5 weken. Herintroductie van dieet gluten viel samen met de terugkeer van dermatitis (C).
Figuur 2. HE kleuring van EM96 makaak huidbiopten verzameld voor (A) en na (B) intrekking van dieet gluten voor 9 weken. A: Epithelium is verdikt (7-15 lagen van epitheliale cellen) met een dikke korst van oppervlakkige hyperkeratotische cellen geïnfiltreerd met degenererende neutrofielen. Neutrofielen verschijnen ook in het epitheel en worden gemengd met een beperkt aantal lymfocyten, plasma cellen, histiocyten en rond de adnexa in de bovenste dermis. B: Sommige hyperkeratosis is nog steeds aanwezig, epitheliale dikte is genormaliseerd (4-7 lagen) met minimale lymphoplasmacytic infiltratie in de bovenste dermis. C: Normaal buikhuid van FR56 makaken, zonder lymphoplasmacytic infiltratie, is opgenomen ter vergelijking. Vergroting 20x.
Figuur 3. Confocale microscopie beelden van EM96 makaak huidbiopten verzameld voor (A) en na (B) intrekking van dieet gluten voor 9 weken. A: IgA vlekken (groen), tTG2 (rood) en Topro-3 nucleair DNA-merker (blauw). Co-lokalisatie van IgA en tTG2 verschijnt in het geel rond het gebied van dermale papilae. B: Huid monster genomen na negen weken van gluten-vrij dieet laat geen IgA in het epitheel, terwijl sommige subepitheliale IgA is nog steeds aanwezig (groen), tTG2 (rood) en Topro-3 nucleair DNA-merker (blauw).
Figuur 4.
| Animal Tag | Seks [M / F] | Leeftijd [Jaren] | Klinische symptomen | Plasma tTG2 antilichamen | Dieet [1,2] * |
| HJ71 | F | 1.3 | Gezond | - | 1 |
| HD13 | M | 1.4 | Gezond, af en toe diarree | + | 1 |
| FR56 | M | 5.4 | Chronische idiopathische diarree | - | 1 |
| EM96 | F | 5.0 | Chronische dermatitis | + / - (Borderline) | 1 en 2 |
| GI24 | F | 4.6 | Chronische dermatitis | - | 1 |
Tabel 1. TNPRC resusmakaken die voor de inzameling van huidbiopten
* Dieet 1 - regelmatige aap chow (gluten-bevattende), Diet 2 - gluten-vrij dieet
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Ons nieuw opgerichte niet-menselijke primaat model van gluten gevoeligheid werd onlangs gebruikt om de darmpermeabiliteit veranderingen ten gevolge van dieet gluten 5,6 bestuderen. Plasma tTG2 antilichamen evenals intestinale tTG2 + IgA + deposito's werden ontdekt in een aantal gluten-gevoelige makaken. Aangezien wij recent geïdentificeerde zeldzame gevallen van idiopathische dermatitis in kolonie rhesus makaken, waar geen gebruikelijke (infectieus / metabole) etiologie kon worden vastgesteld, doel van de...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag Amanda Tardo, Dr Mostafa Bouljihad, Stephanie Feely, Carol Coyne, Dr Erin Ribka, Dr Pete Didier en Dorothy Kuebler bedanken voor hun technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie R01-DK076653 en 3R01-DK076653-02S1 naar KS en de basis exploitatiesubsidie van de TNPRC RR000164.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het serum of de apparatuur | Vennootschap | Catalogus Nummer / Product Code | Noot |
| Anti-Human IgA-FITC * | Sigma, St. Louis, MO | F-5259 | 1:100 werkverdunning |
| Anti-Human tTG2 | Thermo Scientific, Kalamazoo, MI | MS-300-P1ABX | 1:100 werkverdunning |
| Anti-Mouse IgG1 ** | Invitrogen, Carlsbad, Californië | A-21.124 | 1:1000 werkverdunning |
| Topro-3 DNA-probe *** | Invitrogen, Carlsbad, Californië | T-3605 | 1:1000 werkverdunning |
| Zink formaline (Z-fix) | Anatech Ltd, Battle Creek, MI | 171 | |
| Oktober Invriezen Medium | Sakura Finetek, Torrence, CA | 4583 | |
| Cytoseal Montage Medium | Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI | 8312-4 | |
| Anti-Afschrikken Oplossing | Sigma, St. Louis, MO | P 3130 | |
| Ethilon (Nylon Suture) | Ethicon, Johnson & Johnson, Berkshire, Verenigd Koninkrijk | 663G | |
| Miltex Punch Dermaal Biopsie Instrument | Miltex, York, PA | NA | |
| Oster Golden A5 Single Speed Clipper Vet met een grootte van 40 blad | Oster Products, McMinnville, TN | 78005-050 | |
| Leica Tissue Processor | Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, KS | ASP300 | |
| Rotatiemicrotoom | Microm International, Waldorf, Duitsland | HM325 | |
| Cryostaat | Thermo Scientific, Kalamazoo, MI | HM560 | |
| Confocale microscoop | Leica, Wetzlar, Duitsland | TCS SP2 |
* Fluoresceïne isothiocyanaat
** Secundaire (Alexa Fluor 568-geconjugeerd) antilichaam gebruikt na tTG2 primair antilichaam
** Dye
Referenties
- Diosdado, B., Wijmenga, C. Molecular mechanisms of the adaptive, innate and regulatory immune responses in the intestinal mucosa of celiac disease patients. Expert. Rev. Mol. Diagn. 5 (5), 681-700 (2005).
- Schuppan, D., Dennis, M. D., Kelly, C. P. Celiac disease: epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and nutritional management. Nutr. Clin. Care. 8 (2), 54-69 (2005).
- Sardy, M. Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis. J. Exp. Med. 195 (6), 747-757 (2002).
- Rose, C. Autoantibodies against epidermal transglutaminase are a sensitive diagnostic marker in patients with dermatitis herpetiformis on a normal or gluten-free diet. J. Am. Acad. Dermatol. 61 (1), 39-43 (2009).
- Bethune, M. Transepithelial transport and enzymatic detoxification of gluten in gluten-sensitive rhesus macaques. PLoS ONE. 3 (3), e1857-e1857 (2008).
- Mazumdar, K. Visualization of transepithelial passage of the immunogenic 33-residue peptide from α-2 gliadin in gluten-sensitive macaques. PLoS ONE. 5 (4), e10228-e10228 (2010).
- Schuppan, D., Junker, Y., Barisani, D. Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies. Gastroenterol. 137 (6), 1912-1933 (2009).
- Hunt, K. Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response. Nature Genet. 40 (4), 395-402 (2008).
- Abadie, V. Integration of genetic and immunological insights into a model of celiac disease pathogenesis. Annu. Rev. Immunol. 29, 493-525 (2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
