NIH3T3 cellen voorbereiding:
A. Cellen voor Ejection
- Trypsinize cellen, dan verdunnen 1:1 met cel-media, en de transfer van een T75 kolf met een 15 ml Falcon buis
- Spin down cellen in een pellet door centrifugeren, aspireren supernatant en wassen cellen met DPBS
- Spin down cellen in een pellet weer, en zuig supernatans
- Resuspendeer cellen in de media
- Bepaal celdichtheid met hemocytometer (~ 200 X 10 4 cellen / ml per fles T75)
- Centrifuge cel oplossing, aspireren supernatant, en resuspendeer in de juiste hoeveelheid media voor uiteenlopende celconcentraties
B. Cel uitwerpen
- Vortex cellen voordat u voor het uitwerpen
- Overdracht 200 pi van de cel oplossing in de spuit
- Zet juiste modus op pulsgenerator
- Voor het uitwerpen van een enkele druppels en meerdere druppels (uitbarstingen), ingesteld pulsgenerator "E. BUR"-modus
- Voor continue druppel uitwerpen, stelt pulsgenerator op "NORM"-modus
- Veranderen signaal instellingen
- Stel hoog niveau en laag niveau uitgangsspanning: HIL tot 5 V en LOL op 0 V en zorg ervoor dat de "LIM" LED is op
- Stel signaal als een vierkant puls
- Wijzig de hoeveelheid tijd die de magneetklep staat open voor druppel het uitwerpen door het veranderen van de waarde voor "WID" of veranderen duty cycle ("DUTY")
- Verander de frequentie van de uitwerpen door het veranderen van de waarde voor "PER"
- Wijzig het aantal druppels uitgestoten in een uitbarsting door het veranderen van de waarde voor "BUR"
- Eject cel oplossing op voorbereide ondergrond voor beeldvorming met een microscoop
C. kleuring
- Make-up dye-oplossing met 0,5 pi calceïne-AM en 2 pl ethidium homodimeer per ml DPBS
- Dompel bereid substraat in kleurstofoplossing
- Laat monster gedurende 10 minuten incuberen bij 37 ° C voor imaging
Experiment Validatie
- Op een Nikon Eclipse TE-2000 U fluorescentiemicroscoop
- Spot geavanceerde software (Diagnostics, Inc)
- Live / Dead Assay
