Verpakking HIV-of FIV-based Lentivector expressie constructen en transductie van VSV-G pseudogetypeerde virale deeltjes

Samenvatting

Lentivirale expressievectoren zijn het meest effectief voertuigen stabiel tot expressie verschillende effector-moleculen of reporter-constructen in delende en niet-delende zoogdiercellen en hele organismen. Hier bieden we een protocol over hoe lentivector expressie constructen te verpakken in pseudoviral deeltjes en target cellen met behulp van de pseudoviral deeltjes transduceren.

Samenvatting

Zoals met standaard plasmide vectoren is het mogelijk om lentivectors in plasmide vorm transfecteren in cellen met lage tot middelmatig tot transiënte expressie effectors verkrijgen. Verpakking lentivirus expressieconstructen in pseudoviral deeltjes maakt het echter mogelijk tot 100% transductie, zelfs bij moeilijk te transfecteren cellen, zoals primaire, stengel en gedifferentieerde cellen. Bovendien is de lentivirale levering niet het specifieke cellulaire respons doorgaans geassocieerd met chemische transfecties, zoals mobiele overlijden ten gevolge van de toxiciteit van de transfectie reagens ^{1, 2.} Bij getransduceerd in doelcellen, lentivirale construct integreert genomisch DNA en zorgt voor een stabiele expressie van de kleine haarspeld RNA (shRNA), cDNA, microRNA reportergen of ^{3, 4.} Doelcellen stabiel tot expressie de effector-molecule kan worden geïsoleerd met een selecteerbare marker in de expressie vector, zoals het bouwen puromycine of GFP. Na pseudoviral deeltjes infecteren doelcellen kunnen zij niet repliceren in doelwitcellen door de virale structurele genen ontbreken en de lange terminale herhaling (LTR) zijn bedoeld om zelf-inactiverende na transductie ^{5, 6.}

Er zijn drie componenten nodig voor efficiënte lentivirale verpakking ^{1, 5, 6, 7.}

1. De lentivirale expressievector dat sommige genetische elementen voor verpakking, stabiele integratie van de virale expressie-construct in genomisch DNA en expressie van de effector of reporter.
2. De lentivirus verpakking plasmiden eiwitten noodzakelijk voor transcriptie en verpakken van een RNA kopie van de expressie-construct in recombinant pseudoviral deeltjes. Dit protocol maakt gebruik van de PPACK plasmiden (SBI) die coderen voor gag, pol, en toerenteller van de HIV of FIV genoom en vesiculaire stomatitis virus g eiwit (VSV-G) voor de virale manteleiwit.
3. 293TN produceren r cellen (verkregen van HEK293 cellen) die de SV40 grote T antigen, die nodig is voor hoge-titer lentivirus productie en neomycine resistentie gen, nuttig voor de cellen opnieuw te selecteren voor onderhoud drukken.

Een overzicht van de virale productie protocol kan worden gezien in figuur 1. Virale productie begint door co-transfectie 293TN producerende cellen met lentivirale expressievector en de verpakking plasmiden. Virusdeeltjes worden uitgescheiden in de media. Na 48-72 uur de cel cultuur media wordt geoogst. Celresten wordt uit de celkweekmedia, en de virale partikels worden neergeslagen door centrifugeren met PEG-it concentratie. Geproduceerd lentivirus worden vervolgens getitreerd en kan worden gebruikt om doelcellen transduceren. Details van virale titering zijn niet opgenomen in dit protocol, maar is te vinden op:

Ank "> http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf ^8.

Dit protocol is geoptimaliseerd met de specifieke producten zijn aangegeven. Andere reagentia kunnen worden vervangen, maar dezelfde resultaten kunnen worden gegarandeerd.

Protocol

1. Transfectie van 293TN Cellen met Packaging Plasmids en de expressie-construct

1. Zaad 7,0 tot 8,0 x 10 ⁶ 293TN cellen per 15 ^cm2 petrischaal in 20 ml kweekmedium met DMEM medium aangevuld met 4 mM L-glutamine, 4,5 g / l glucose en foetaal runderserum (10%) zonder antibiotica. Groei gedurende 18-24 uur bij 37 ° C met _5% CO2, zodat de celdichtheid 60-80% confluentie bereikt bij de transfectie. In sommige gevallen kan het nodig zijn zaad meerdere platen cellen om een ​​voldoende hoge titer voor transductie van doelcellen verkrijgen.
2. Voor elke plaat van cellen, voeg 1,6 ml serum-vrij DMEM tot een autoclaaf 2 ml Eppendorff buis. Voeg 45 ul pPACKH1 of pPACKF1 en 4,5 ug van uw lentivector te maken die aan de DMEM en meng door en neer te pipetteren.
3. Voeg 55 ul van PureFection in dezelfde buis. Vortex gedurende 10 seconden. Incubeer de DMEM-plasmide-PureFection mengsel bij kamertemperatuur fof 15 minuten.
4. Voeg de DMEM-plasmide-PureFection mengsel aan de weefselkweek plaat druppelsgewijs en schud zachtjes gelijkmatig te verspreiden in de hele plaat. Breng de schotel naar de incubator en groeien bij 37 ° C met _5% CO2.
5. Het is niet nodig om de media veranderen na transfectie. Als uw lentivector constructie drukt een gen dat codeert voor een fluorescerend eiwit als GFP, controleert u de cellen onder een microscoop 12-24 uur na transfectie. Je moet in staat zijn om> 90% GFP-positieve cellen te zien, wat aangeeft dat de transfectie is geslaagd.
6. Verzamelt de celkweeksupernatant na 48 en 72 uur in een 50 ml steriel centrifugebuis. Deze celcultuur supernatant bevat nu besmettelijke pseudoviral deeltjes. (Volg de aanbevolen richtlijnen voor het werken met BSL-2 veiligheidsklasse.) Centrifugeer bij 1.500 xg gedurende 15 min bij kamertemperatuur pellet de cellulaire puin. Breng de virale supernatant naar een nieuwe buis, verzekert dat de pellet verstoren.
7. 293TN cellen die zijn gebruikt voor virale verpakking moet van een biologisch container en niet worden gebruikt voor volgende ronden van virale verpakking.

2. Concentratie van de Viral Supernatant

1. Voeg 1 volume koude (4 ° C) PEG-it Virus Precipitatieoplossing elke 4 delen lentivirus deeltjes bevattende supernatant. Precipitatie van lentivirus deeltjes van grote hoeveelheden kunnen worden bereikt met Corning 250 ml polypropyleen centrifugebuis. Meng de oplossing door het omkeren van de buizen een paar keer, maar niet vortex het mengsel.
2. Koel de oplossing bij 4 ° C gedurende ten minste 12 uur (tot 4 dagen zijn). Niet schudden of draaien de buizen tijdens de koeling stap.
3. Centrifugeer de supernatant / PEG-het mengsel bij 1500 g gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Na centrifugeren de lentivirale deeltjes als een beige of wit pellet aan de bodem van de buis. Giet de supernatant.
4. Verwijder alle sporen van vocht door aspiratie, zorg ervoor dat u de neergeslagen lentivirale deeltjes in de pellet te verstoren. Spoor van residuele PEG-zal het virus verdunnen (waardoor de titer) maar niet de integriteit van de doelwitcellen, omdat PEG-het inert en niet giftig beïnvloeden.
5. Resuspenderen en combineren lentivirale deeltjes in 1/100 van de oorspronkelijke volume koude (4 ° C), steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing of DMEM dat 25 mM HEPES buffer.
6. Aliquot in steriele cryogene flesjes en bewaar bij -70 ° C tot aan gebruik.

3. Virale Titering en transductie van target cellen

1. Wij raden titering de lentivirale deeltjes voordat transduceren de doelcellen-of-interest en de berekening van de juiste multipliciteit van infectie (MOI) voor de doelcellen voor de samenhang tussen experimenten. Voor virale titering, raden wij u aan HT1080 cellen als een eenvoudig te infecteren positieve controle lijn. Plgemak er rekening mee dat de titering protocol omvat transduceren HT1080 cellen met een kleine hoeveelheid van de lentivirale deeltjes je hebt verpakt. Zodra de titer bekend is, kan de doelcellen of interest worden getransduceerd met de geproduceerde lentivirale deeltjes. Een adviseren titering protocol is te vinden op: http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf ^7.
2. Plaat 50.000 doelcellen-of-interest per putje in een 24-wells plaat in celcultuur media. Gebruik de media dat de cellen normaal worden gekweekt binnen Grow de cellen 's nachts op hun specifieke kweekomstandigheden. Cellen moet 50 tot 70% confluent op de dag van transductie.
3. Op de dag van transductie, zuigen de media uit de cellen. Combineer kweekmedium met TransDux een 1 x eindconcentratie (bijvoorbeeld 2,5 pi TransDux 500 ul kweekmedium). Breng het TransDux-cell kweekmedium mengsel aan elke well.
4. Pipetteer de juiste hoeveelheid virus die overeenkomt met de optimale MOI de doelcellen in elk putje. Indien de optimale MOI onbekend, raden proberen een aantal verschillende MOIS (zoals een MOI 1, 2 en 5 gemakkelijk te infecteren weefselkweekcellen en een MOI 1, 10 en 20 voor moeilijk -infecteren primaire cellen). Indien de concentratie van de deeltjes lentivirale niet bekend is (als bepaald door een virus titering protocol) kunnen verschillende hoeveelheden virus worden beproefd, zoals 1, 2 en 5 ul virus. Virus kunnen blijven in contact met de doelcellen tot 72 uur.
5. Verdere experimenten met de getransduceerde doelwitcellen of interest kan 72 uur begonnen na transductie, wanneer de virale construct is geïntegreerd in het gastheercelgenoom. Wijzig de medium en passage de doelcellen-of-interest op basis van hun specifieke behoeften.

4. Representatieve resultaten

Transfectie van 293TN cellen

Het uitgangspunt dichtheid van de 293TN cellen is cruciaal voor een succesvolle virale verpakking. 293TN cellen moeten 60 80% confluente de dag van transfectie (Figuur 2). Als de 293TN cellen minder dan 60% samenvloeiing, laat ze nog een paar uur te groeien voordat u de transfectie. Als de cellen 293TN> 80% confluent, moeten zij worden uitgeplaat voor transfectie.

Bij gebruik van een lentivector expressie GFP, ten minste 90% van de cellen 293TN fluoresceren groen 24 uur na de transfectie, aan te geven dat transfectie (Figuur 3). Indien minder dan 90% van de cellen GFP-positieve, niet naar de volgende stap omdat dit dat de transfectie niet succesvol was, en de virale titers laag zijn. In plaats daarvan plaat nieuwe 293TN cellen en opnieuw te beginnen, zorg ervoor dat de 293TN cellen op de juiste celdichtheid voor transfecteren.

293TN cellen kunnen trekken uit de weefselkweek platen 48-72 uur na transfectie. Dit heeft geen negatieve invloed hebben op de productie van lentivirale deeltjes.

Titering met HT1080 Cellen

Virale titers kan worden berekend met behulp van Global ultrasnelle SBI's Titering kit volgens de instructies van de fabrikant. Het systeem maakt gebruik van virale qPCR integratie van de sequentie WPRE meten van de lentivirale in HT1080 cellen en vergelijkt dit met een standaard curve, gebaseerd op een genomische referentiesequentie nauwkeurig meten infectieuze eenheden per ml (Fig. 4).

Transductie van doelwitcellen

Bij gebruik van lentivirale deeltjes het uitdrukken van een constitutief actieve GFP merker, moet GFP positieve cellen beginnen te verschijnen binnen 12-24 uur na transductie, als de transductie reactie werkt. GFP-expressie moet worden voortgezet na de lentivirale constructie stabiel te integreren met thij gastheercelgenoom. Als transduceren met verschillende MOIS, moet de GFP-fluorescentie ongeveer overeen met de MOI, waar lage MOIS tonen minder GFP-fluorescentie en hoger MOIS blijkt een toegenomen GFP-fluorescentie (figuur 5).

Figuur 1. Overzicht van de virale productie protocol. De lentivector en PPACK verpakking plasmiden worden gemengd en geco-transfecteerd in cellen 293TN. Na 48 -72 uur wordt het virale supernatant verzameld en virale deeltjes worden neergeslagen met PEG-it. Na titering de lentivirale deeltjes, kunnen ze worden gebruikt om de doelcellen-of-interest transduceren. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2. Fase contrast beeld van 293TN cellen. Cell density moet 60-80% confluent de dag van de transfectie.

Figuur 3. Fluorescent beeld van GFP-positieve 293TN cellen 24 uur na transfectie met Purefection, pPACKH1 en een lentivector construct codeert GFP.

Figuur 4. WPRE qPCR resultaten en de standaard curve verkregen met behulp van Global ultrasnelle SBI's Titering kit om MOI en bijbehorende titer van verpakte virale deeltjes te berekenen.

Figuur 5. Fluorescent beelden HT1080 cellen getransduceerd met toenemende hoeveelheden lentivirus. Foto's zijn vanaf 72 uur na transductie.

Discussie

Deze virale verpakking en transductie van target cellen protocol is geoptimaliseerd voor gebruik met virale verpakking SBI's reagentia. Vervanging van andere reagentia kunnen invloed hebben op de uitkomst van het protocol. Dit protocol is alleen geoptimaliseerd voor lentivirale productie en mogelijk niet geschikt voor de productie van andere soorten virussen of pseudovirussen.

Succesvolle virale verpakking is afhankelijk van een aantal belangrijke stappen. De 293TN cellen drukken de SV40 grote T antigen, wat absoluut noodzakelijk is voor afscheiding van het lentivirale deeltjes in de cel cultuur supernatant. De dichtheid van de cellen 293TN bij de transfectie is vooral van belang om de PureFection reagens voldoende overdragen lentivector en verpakking plasmiden in de cellen. Het toevoegen van de PureFection mengsel aan de weefselkweek plaat in een druppelsgewijze manier gevolgd door grondig te zwenken de plaat is belangrijk voor de verspreiding van de verpakking plasmidenen lentivector bouwen in alle van de cellen. Niet juiste verdeling van de vectoren kunnen leiden tot onvoldoende lentivirus deeltjes geproduceerd. De virale verpakking reactie kan worden opgeschaald voor de productie van hoge titer virus op het oppervlak van het weefsel kweekplaten. Er kan gekozen worden tot op het bord verschillende weefsel-cultuur schotels van 293TN cellen per construct dat moet worden verpakt. Concentratie van de virale supernatanten is vooral handig bij het maken van hoge titer virus. Virale supernatant uit meerdere platen cellen kunnen worden gecombineerd en geconcentreerd voor gebruik in in vivo experimenten of cellen die moeilijk te transduceren.

Titering de geproduceerde lentivirale deeltjes is belangrijk voor de berekening een nauwkeurige MOI gebruiken voor transductie van doelcellen. Het kennen van de MOI die werd gebruikt in een bepaalde transductie in staat stelt het oplossen van problemen in het geval dat de transductie niet succesvol is. Bijvoorbeeld met een moi diete laag kan in enkele beoogde cellen die de sequenties van belang. Met een moi die te hoog is, kan echter resulteren in doelcellen tekenen van spanning vertonen. Het doel is het gebruik van een MOI dat de expressie van het construct-of-interest maximaliseert met behoud van de gezondheid van de cellen. Hoewel wij bevelen qPCR gebaseerde titering protocol geïntegreerde kopieën van het construct in lentivirale HT1080 cellen meet, kunnen andere titering methoden worden gebruikt, zoals p24 ELISA of schatting van het percentage GFP-positieve cellen.

Succesvolle transductie van target cellen is ook afhankelijk van een aantal belangrijke factoren. TransDux is een uniek infectie reagens dat hoge transductie efficiëntie mogelijk maakt, maar dat is niet toxisch voor cellen. TransDux kan worden gebruikt in plaats van polybreen, die vaak giftig is voor de doelcellen. Opneming van TransDux in de transductie van de doelwitcellen helpt kosten neutraliseren van het virale deeltjes en kan het virus in de cels. Aangezien TransDux niet toxisch voor de cellen, kan men laat de lentivirale deeltjes in contact met de cellen blijven tot 72 uur (de tijd waarop de virale constructen zijn geïntegreerd in het gastheercelgenoom), waardoor de waarschijnlijkheid van de virale deeltjes in de cel. Voor sommige moeilijk te transduceren cellen, kan transductions worden herhaald op opeenvolgende dagen op de transductie efficiëntie te verhogen. Bijvoorbeeld, transduceren de cellen op dag 1, laat de cellen te rusten op dag 2, en dan weer transduceren de cellen op dag 3. Het is belangrijk 72 uur wachten na de laatste transductie voor het begin selectie verdere experimenten of karakterisering van de doelcellen.

Efficiënte virale verpakking is afhankelijk van de grootte van de lentivirale construct, tussen de 5 'en 3'LTR gebieden. Dit deel van de lentivirale construct moet ongeveer 9 kb of minder, hetgeen overeenkomt met de grootte van de oorspronkelijke HIV genoom. Meer dan 9 kb kan deplooi de titer van het geproduceerde pseudoviral deeltjes. Nieuwe technologie, zoals piggyBac transposon vectoren mogelijk betrouwbare, stabiele integratie van transgenen tot 100 kb via een transfectie. Deze benadering kan worden gebruikt voor constructen die de grootte voor lentivirale vectoren, wanneer het mogelijk is om transfecteren doelcellen overschrijden en biedt het bijkomende voordeel dat er geen een virale verpakkingsstap ^9,10.

De geproduceerde pseudoviral deeltjes met dit protocol infectueus in dat ze het meest zoogdiercel types infecteren. De producten die gebruikt worden in dit protocol, echter zijn de derde generatie BioSafe in dat ze produceren niet-replicatieve en zelf-inactiverende pseudovirussen. Daarom, zodra getransduceerde in doel-cellen of dieren, de doelcellen of dieren zijn niet besmettelijk of besmettelijk. Vervanging van andere lentivector plasmiden die niet van de derde generatie BioSafe is mogelijk, maar niet aan te raden van een bioveiligheidperspectief. De virale productie-protocol en de daarop volgende transductie van target cellen moeten worden uitgevoerd onder Biosafety Level 2, volgens de NIH richtlijnen ¹¹ en onderzoekers moeten altijd een laboratoriumjas en handschoenen bij het ​​hanteren van de virale deeltjes. Gebruikt 293TN producerende cellen moeten tubes van virale deeltjes, en wegwerp pipetten worden weggegooid in een geschikte biohazard container. Herbruikbare pipetten en glaswerk moet worden ontsmet met bleekwater en autoclaveren om de blootstelling van het personeel te verminderen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
DMEM Hoge Glucose Medium	Gibco	11995-073
293TN Cellen	SBI	LV900A-1
pPACKH1	SBI	LV500A-1	Voor HIV-gebaseerde lentivectors
pPACKF1	SBI	LV100A-1	Voor FIV-based lentivectors
Elke Lentivirale vector	SBI	Diverse	cDNA, shRNA, microRNA, transcriptie verslaggevers
PureFection	SBI	LV750A-1 LV750A-5
PEG-it	SBI	LV810A-1 LV825A-1
Global ultrasnelle Titering kit	SBI	LV961A-1	Niet beschreven in dit protocol, maar nodig is om de virale deeltjes titer
TransDux	SBI	LV850A-1