Een stap RT-PCR voor de detectie en genogroup identificatie van Norovirus isolaten van kinderen ontlasting dat primers en TaqMan probes specifiek voor de open reading frame 1 (ORF1)-ORF2 grensgebied, de geconserveerde regio van de Norovirus genoom gebruikt beschreven. Een niet-commerciële, kosteneffectieve RNA-extractie methode wordt beschreven.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Detectie en Genogrouping van Norovirussen van Children's Krukken Door Taqman een stap RT-PCR
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Norovirussen (NoVs) zijn de belangrijkste oorzaak van het uitbreken van sporadische acute gastro-enteritis over de hele wereld bij mensen van alle leeftijden. Zij zijn belangrijke oorzaak van ziekenhuisopnamen bij kinderen met volksgezondheidseffect vergelijkbaar met die van Rotavirus. NoVs zijn RNA virussen grote verscheidenheid genetische en er een continue weergave van nieuwe stammen. Vijf genogroepen worden erkend; GI en GII met hun vele genotypen en subtypen het meest belangrijk zijn voor menselijke besmetting. Echter, de diagnose van deze twee genotypes blijft problematisch, het uitstellen van diagnose en behandeling. 1, 2, 3
Voor RNA-extractie uit ontlasting specimens de meest gebruikte methode is de QIAmp Viraal RNA commerciële kit Qiagen. Deze methode worden de bindende eigenschappen van een silicagel membraan buffers die controle RNAses, voor een optimale binding van de RNA de kolom met de snelheid van Microspin. Deze methode is eenvoudig, snel en betrouwbaar en is carrIED in een paar stappen die worden beschreven in de beschrijving van de fabrikant.
Norovirus is de tweede alleen voor rotavirus de meest voorkomende oorzaak van diarree. Norovirus diagnose moet beschikbaar zijn in alle onderzoeken naar pathogenese van diarree en bij uitbraken of individuele diarree gevallen. Momenteel echter norovirus diagnose slechts een beperkt aantal centra door het ontbreken van eenvoudige technieken voor de diagnose. Dit vertraagt de diagnose en behandeling 1, 2, 3. Daarnaast is vanwege de kosten en gereguleerde transport van corrosieve buffers binnen en tussen landen het gebruik van deze gefabriceerde kits stelt logistieke problemen. Hierdoor, in dit protocol beschrijven we een alternatieve, economisch eigen methode is gebaseerd op de originele Boom et al.. Methode 4 waarin het nucleïnezuur bindingseigenschappen van silicadeeltjes gebruikt samen met de anti-nuclease eigenschappen guanidiniumthiocyanaat .
et al.. 5 is beschreven. Sequencing van het PCR-product van de conventionele PCR maakt de differentiatie van genotypes die tot GI en GII genogroepen.
Protocol
1. Kruk Monsters
- Kruk stalen worden bevroren om het RNA te behouden. Om een 10% fecale suspensie te maken, duurt ongeveer 0,1 g ontdooide stoelgangstaal en vul tot 1 ml met PBS.
- Aliquot in 200 ul om te voorkomen dat Herhaald invriezen en ontdooien. Bewaar de monsters bij -70 ° C
- Ontdooien en centrifugeer aliquots bij 4.000 g gedurende 10 minuten voor gebruik in extractie.
2. Voorbereiding van de silica deeltjes voor de extractie met Guanidine & Silica
- Bij kamertemperatuur, schorten 30 g siliciumdioxide en compleet met dH 2 O 250 ml.
- Na 24 uur van sedimentatie verwijder....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De economische eigen methode voor het isoleren van nucleïnezuur uit ontlasting wij gelijke resultaten verkregen als bij de commerciële QIAmp Viraal RNA kit Qiagen, samen met de TaqMan RT-PCR ontwikkeld in ons laboratorium kunnen detecteren breed NoV genotypen die behoren tot de GI en GII genogroup. Een recente publicatie van de regio C-protocol gemeld genotypering tarieven van 78% 6. Omdat de diversiteit van de hedendaagse NoV stammen is toegenomen in de voorgaande jaren zal het succes afhankelijk is van de m.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag naar het Nationaal Calicivirus Laboratorium Center for Disease Control and Prevention (CDC) bedanken voor de vriendelijke gift van een standaard en controle positieven voor de NOV, en de laboratoria van de School of Public Health aan de Johns Hopkins voor het leveren van de reagentia.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het serum | Vennootschap | Catalogusnummer | Reacties |
| Guanidine isothiocyanaat | Sigma-Adrich | G9277 | |
| Tris HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Silica | Sigma-Aldrich | S5631 | |
| Triton X 100 | BDH Chemicals | 14530 | |
| Diethylpyrocarbonaat | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| QIAamp viraal RNA Mini Kit (250) | QIAGEN | 52906 | |
| KwantitatieveTec Probe RT-PCR kit (200) | QIAGEN | 204443 | |
| Qiagen One Step RT-PCR kit (200) | QIAGEN | 210212 | |
| RNase-remmer 2000 stuks | A.Biosystems | N808-0119 | 2000 unids / flacon |
| Non-Stick Rnae-free microfuge Tubes | Ambion | AM12450 | |
| UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550-100 |
Referenties
- Medici, M. Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy. L. Medical Virology. 78, (2006).
- Vidal, R. Novel recombin....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
