Detectie en Genogrouping van Norovirussen van Children's Krukken Door Taqman een stap RT-PCR

Samenvatting

Een stap RT-PCR voor de detectie en genogroup identificatie van Norovirus isolaten van kinderen ontlasting dat primers en TaqMan probes specifiek voor de open reading frame 1 (ORF1)-ORF2 grensgebied, de geconserveerde regio van de Norovirus genoom gebruikt beschreven. Een niet-commerciële, kosteneffectieve RNA-extractie methode wordt beschreven.

Samenvatting

Norovirussen (NoVs) zijn de belangrijkste oorzaak van het uitbreken van sporadische acute gastro-enteritis over de hele wereld bij mensen van alle leeftijden. Zij zijn belangrijke oorzaak van ziekenhuisopnamen bij kinderen met volksgezondheidseffect vergelijkbaar met die van Rotavirus. NoVs zijn RNA virussen grote verscheidenheid genetische en er een continue weergave van nieuwe stammen. Vijf genogroepen worden erkend; GI en GII met hun vele genotypen en subtypen het meest belangrijk zijn voor menselijke besmetting. Echter, de diagnose van deze twee genotypes blijft problematisch, het uitstellen van diagnose en behandeling. ^{1, 2, 3}

Voor RNA-extractie uit ontlasting specimens de meest gebruikte methode is de QIAmp Viraal RNA commerciële kit Qiagen. Deze methode worden de bindende eigenschappen van een silicagel membraan buffers die controle RNAses, voor een optimale binding van de RNA de kolom met de snelheid van Microspin. Deze methode is eenvoudig, snel en betrouwbaar en is carrIED in een paar stappen die worden beschreven in de beschrijving van de fabrikant.

Norovirus is de tweede alleen voor rotavirus de meest voorkomende oorzaak van diarree. Norovirus diagnose moet beschikbaar zijn in alle onderzoeken naar pathogenese van diarree en bij uitbraken of individuele diarree gevallen. Momenteel echter norovirus diagnose slechts een beperkt aantal centra door het ontbreken van eenvoudige technieken voor de diagnose. Dit vertraagt ​​de diagnose en behandeling ^{1, 2, 3.} Daarnaast is vanwege de kosten en gereguleerde transport van corrosieve buffers binnen en tussen landen het gebruik van deze gefabriceerde kits stelt logistieke problemen. Hierdoor, in dit protocol beschrijven we een alternatieve, economisch eigen methode is gebaseerd op de originele Boom et al.. Methode ⁴ waarin het nucleïnezuur bindingseigenschappen van silicadeeltjes gebruikt samen met de anti-nuclease eigenschappen guanidiniumthiocyanaat .

et al.. ⁵ is beschreven. Sequencing van het PCR-product van de conventionele PCR maakt de differentiatie van genotypes die tot GI en GII genogroepen.

Protocol

1. Kruk Monsters

1. Kruk stalen worden bevroren om het RNA te behouden. Om een ​​10% fecale suspensie te maken, duurt ongeveer 0,1 g ontdooide stoelgangstaal en vul tot 1 ml met PBS.
2. Aliquot in 200 ul om te voorkomen dat Herhaald invriezen en ontdooien. Bewaar de monsters bij -70 ° C
3. Ontdooien en centrifugeer aliquots bij 4.000 g gedurende 10 minuten voor gebruik in extractie.

2. Voorbereiding van de silica deeltjes voor de extractie met Guanidine & Silica

1. Bij kamertemperatuur, schorten 30 g siliciumdioxide en compleet met dH ₂ O 250 ml.
2. Na 24 uur van sedimentatie verwijderen 215 ml van de supernatant door afzuigen. Voeg dH ₂ O tot 250 ml, en hang de silica pellet door schudden.
3. Na nog 24 uur, de bovenstaande vloeistof door afzuigen en de pH van de silica suspensie op pH 2,0 met zoutzuur (HCl). Aliquot de silica suspensie in glazen botrust is gekomen en autoclaaf.

3. Voorbereiding van L6 buffer voor Extractie met Guanidine & Silica

1. Bij KT, bereid door oplossen L6 buffer 60 g guanidiniumthiocyanaat (GuSCN) en 1,3 g Triton X-100 in 50 ml 0,1 M Tris-hydrochloride, pH 6,4 en 11 ml van een 0,2 M EDTA, pH 8,0 oplossing.

4. Voorbereiding van de L2-buffer voor Extractie met Guanidine & Silica

1. Bij KT, bereid door oplossen L2 buffer 180 g guanidiniumthiocyanaat (GuSCN) in 150 ml 0,1 M Tris-hydrochloride, pH 6.4.

5. Extractieprocedure

1. In elke extractie een NoV positief stoelgangstaal, als positieve controle, en DEPC behandeld water, als negatieve controle, moeten worden opgenomen.
2. In een micro-centrifugebuis mengen volgende: 1 ml buffer L6, 20 pi van silicadeeltjes en voeg 200 pi van 10% faecale extract suspensie. Vortex kort en laat bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
3. Centrifugeer de suspensie bij 6000 g gedurende 10 s en was de pellet met 1 ml buffer L2 tweemaal gevolgd door twee wasbeurten met 70% ethanol en eenmaal met aceton. Droog de pellet in een droge verwarmingsblok bij 56 ° C gedurende 5 minuten.
4. Hydraat het RNA in de silica pellet door toevoeging van 50 ul van RNAse-vrij dH ₂ 0. Voeg 1 ul van RNAsin, meng door de buis en incuberen bij 56 ° C gedurende 15 minuten.
5. Centrifugeer 3 min op volle snelheid, in een tafelblad centrifuge, en verzamelen 40 pl van de supernatant die de RNA.
6. Kwantificeer de geëxtraheerde RNA monsters met behulp van NanoDrop 2000 spectrofotometer (Thermo wetenschappelijke). Dan slaan bij -70 ° C tot gebruik, tot 6 maanden. (Opmerking: Een betere manier om totaal RNA te behouden intact wordt omgezet in cDNA).

6. Alternatief extractie met behulp van het Handelsregister RNA QIAamp Viral RNA kit

Volledige instructies zijn te vinden in het boekje provzijdig de QIAGEN kit. Kort de procedure als volgt:

1. Pipetteer 560 pi buffer AVL met de drager RNA in een 1,5 ml buis en voeg 140 pi 10% kruk suspensie. Mix van puls-vortexen gedurende 15 sec. Incubeer bij RT gedurende 10 minuten.
2. Voeg 560 ul van ethanol (96-100%) aan het monster en meng door de puls-vortexen 15 sec, dan kort centrifugeren.
3. Breng 630 pi van deze oplossing een spin kolom in een 2 ml verzamelbuis. Centrifugeer 1 min bij 6000 g; dan spin kolom te plaatsen in een schone buis 2 mL.
4. Was de kolom met gebonden RNA met 500 pl van Buffer AW1 en centrifugeer bij 6.000 g gedurende 1 minuut. Plaats kolom in een schone 2 ml verzamelbuis.
5. Was de kolom met 500 pi buffer AW2 en centrifugeer op volle snelheid (20.000 g of 14.000 rpm) gedurende 3 minuten.
6. Plaats spin-kolom in een schoon 1,5 ml micro-centrifugebuis, voeg 40 ul DEPC-behandeld water en elueer het RNA op volle snelheid. Herhaal dit aance een laatste 80 pi RNA geëlueerd.
7. Kwantificeer de geëxtraheerde RNA monsters met behulp van NanoDrop 2000 spectrofotometer (Thermo wetenschappelijke). Dan slaan bij -70 ° C tot gebruik, tot 6 maanden. (Opmerking: Een betere manier om totaal RNA te behouden intact wordt omgezet in cDNA).

7. Detectie van Norovirus in geëxtraheerde RNA door een stap Real Time RT-PCR met specifieke Taqman Probes

Instrument StepOnePlus Real Time PCR Systems (Applied Biosystems).

Methodologie

1. Veeg-en Reinig alle werkvlakken, pipetten en centrifuges met RNase AWAY om mogelijke RNase verontreiniging te verwijderen.
2. Pipetteer de NOV GI en GII screening mastermengsels volgens tabel 1. Primers en Taqman probes staan ​​in tabel 2.
3. Aliquot 10 pi van een passende master mix aan elke reageerbuis.
4. Voeg 5 pi zuivere onbekend monsterRNA, DEPC behandelde water als negatieve controle, of GI respectievelijk GII positieve controle RNA aan de overeenkomstige reactie putten. Alle monsters moet worden uitgevoerd in tweevoud. Positieve controles en normen met een concentratie van 300 ug / ul en 500 ug / ul respectievelijk werden verstrekt door de Nationale Calicivirus Laboratorium Center for Disease Control and Prevention (CDC).
5. Centrifugeer de reactie plaat bij 6.000 g gedurende 10 sec.
6. In het experiment eigenschappen scherm te definiëren en selecteer een soort van experiment voor de run. Zorg ervoor dat TaqMan reagentia worden weergegeven als de reagentia type, en dat de Pre-PCR lezen en versterking zijn geselecteerd.
7. Voer 15 pi reacties met het thermische profiel in tabel 3.
8. Analyseer de resultaten.

8. Genotypering van NoV GI en GII met behulp van conventionele RT-PCR en Sequencing

(Het is niet in deze video, omdat het een gebruikte en meest gebruikte methode.)

Instrument. Applied Biosystems StepOne en StepOnePlus Real Time PCR-systemen met de Quantitec sjabloon.

Methodologie

1. Voor genotypering worden de genogroup (GI of GII) van de monsters door de screening RT-PCR zoals hierboven beschreven. GI NoV RNA moet worden versterkt met het GI-genotypering master mix en de GII NoV RNA met de GII genotypering master mix.
2. Pipetteer de NOV GI en GII genotypering mastermengsels volgens tabel 4. Primers GI SKF / SKR en G2 SKF / SKR staan ​​vermeld in tabel 5.
3. Aliquot 45 pl van de juiste master mix met 0,2 ml reageerbuisjes.
4. Voeg 5 pi DEPC-behandeld water elke negatieve controle buis en 5 pi gescreende, NoV (GI en / of GII) positief RNA de bijbehorende reactiebuis.
5. Voer 50 pL reacties met het thermische profiel in tabel 6.
6. Stuur PCR-producten containing ten minste 100 ng / pl van de versterkte capside regio Company Macrogen voor de zuivering en sequencing. (9700 Grote Seneca Hwy. Rockville, MD 20850 en $ 10 per monster per sequencing).

9. Representatieve resultaten

Figuur 1 toont representatief resultaat van de Taqman een-staps RT-PCR assay gebruikt als RNA, geëxtraheerd uit ontlasting van diarree kinderen. De drempel cyclus (Ct) voor een positief monster werd vastgesteld op minder of gelijk aan Ct 37 voor gastro-intestinale en Ct 39 voor GII. De Ct-waarden voor de positieve controles bleken te zijn minder dan 27 en 18 van het ORF1-ORF2 knooppunt voor GI en GII, respectievelijk. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2

Master Mix	Laatste Conc	Volume (pi)
H 2 0 PCR		2,875
Quantitect RT-PCR Master Mix	1x	6,250
RT Mix	1x	0,125
50 pM Cog R primer	1 pM	0,250
50 pM Cog F primer	1uM	0,250
Ring 10 uM probe	1 pM	0.125/0.250 *
		10,00

* 0,250 pi van elke probe werd gebruikt voor testen GI, terwijl 0,125 pi van elke probe werd gebruikt voor testen GII.

Tabel 1. Qiagen Quantitect master mix voor screening GI en GII (Trujillo et al., 2006). ^7.

Naam	Geno-groep	Gebruiken	Sequentie (5 'naar 3')
Cog 1R	GI	Grondverf	CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C
Cog 1F	GI	Grondverf	CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA
Cog 2R	GII	Grondverf	TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA
Cog 2F	GII	Grondverf	CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG
Ring 1A	GI	Sonde	FAM-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-BHQ-1
Ring 1B	GI	Sonde	FAM-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-BHQ-1
Ring2-TP	GII	Sonde	FAM-TGG GAG GAT GGC CGC AAT CT-BHQ-1

Tabel 2. Primer en probe-oligonucleotiden gebruikt voor real-time kwantitatieve RT-PCR voor genogroepen I, II (Kageyama et al..,2003). ⁸

Stap	(° C)	Tijd (min)
1	50	30:00	cDNA synthese
2	95	15:00	HotStart Taq polymerase activering
3	95	00:15
	60	01:00	45X cycli

Tafel3. Thermische profiel voor een stap Taqman Real-time RT-PCR (Trujillo et al., 2006). ^7.

Master Mix	Laatste Conc	Volume (pi)
H 2 0 PCR		29,50
5x Qiagen RT-PCR-buffer	1x	10,00
10 mM dNTP Mix	0,4 mM	2,00
Enzymmengsel		2,00
40 U / ul RNAsin	20 U / ul	0,50
10 uM SKF	0,1 uM	0,50
10 uM SKR	0,1 uM	0,50
		45,00

Tabel 4. Qiagen One-Step RT-PCR Master Mix voor genotypering GI en GII.

Naam	Geno-groep	Gebruiken	Sequentie (5 'naar 3')
G1SKF	GI	Grondverf	5'-CTG CCC GAA TTY GTA AAT-GA - 3
G1SKR	GI	Grondverf	5'-CCA ACC CAR CCA TTR TAC A - '3
G2SKF	GII	Grondverf	5'-CNT GGG GCG AGG ATC GCA A - 3
G2SKR	GII	Grondverf	5'-CCR CCN GCA TRH CCR TTR TA CAT-3

Tabel 5. Primers gebruikt voor amplificatie van gebied C van capside Region (Kojima et al.. 2002) ^5.

Stap	(° C)	Tijd (min)
1	60	30:00	cDNA synthese
2	96	15:00	HotStart Taq polymerase activering
3	94	00:030
	52	01:00	40X cycli
	72	00:30
4	72	10:00	Gloeien

Tabel 6. Thermische profiel voor Taqman One-Step RT-PCR.

Discussie

De economische eigen methode voor het isoleren van nucleïnezuur uit ontlasting wij gelijke resultaten verkregen als bij de commerciële QIAmp Viraal RNA kit Qiagen, samen met de TaqMan RT-PCR ontwikkeld in ons laboratorium kunnen detecteren breed NoV genotypen die behoren tot de GI en GII genogroup. Een recente publicatie van de regio C-protocol gemeld genotypering tarieven van 78% ^6. Omdat de diversiteit van de hedendaagse NoV stammen is toegenomen in de voorgaande jaren zal het succes afhankelijk is van de m...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
Guanidine isothiocyanaat	Sigma-Adrich	G9277
Tris HCL	Sigma-Aldrich	T5941
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Silica	Sigma-Aldrich	S5631
Triton X 100	BDH Chemicals	14530
Diethylpyrocarbonaat	Sigma-Aldrich	D-5758
QIAamp viraal RNA Mini Kit (250)	QIAGEN	52906
KwantitatieveTec Probe RT-PCR kit (200)	QIAGEN	204443
Qiagen One Step RT-PCR kit (200)	QIAGEN	210212
RNase-remmer 2000 stuks	A.Biosystems	N808-0119	2000 unids / flacon
Non-Stick Rnae-free microfuge Tubes	Ambion	AM12450
UltraPure Agarose 1000	Invitrogen	16550-100