Monitoring Equilibrium veranderingen in RNA structuur door 'Peroxidative' en 'Oxidatieve' hydroxyl radicaal Footprinting

Summary

Dit protocol beschrijft hoe het kwantificeren van de Mg (II)-afhankelijke vorming van RNA tertiaire structuur door twee methoden van hydroxyl-radicaal voetafdruk.

Abstract

RNA-moleculen spelen een essentiële rol in de biologie. Naast het overbrengen van genetische informatie, kan RNA vouwen in unieke tertiaire structuren vervullen van een specifieke biologische rol als regelgever, bindmiddel of katalysator. Informatie over de tertiaire formatie contact is essentieel voor de functie van RNA-moleculen te begrijpen. Hydroxyl-radicalen (• OH) zijn uniek probes van de structuur van nucleïnezuren vanwege hun hoge reactiviteit en de geringe afmetingen. ¹ Bij gebruik als een footprinting probe, hydroxyl-radicalen kaart het oplosmiddel bereikbare buitenzijde van het fosfodiester ruggengraat van DNA en RNA ^{een 2} met zo fijn als single nucleotide resolutie. Hydroxyl radicaal footprinting kan worden gebruikt om de nucleotiden in een intermoleculaire contact oppervlak, bijvoorbeeld in DNA-eiwit ¹ en RNA-eiwit complexen te identificeren. Evenwicht ³ en kinetische ^vier overgangen kan worden bepaald door het uitvoeren van hydroxyl radicaal footprinting als een functie van een solutiop variabele of tijd, respectievelijk. Een belangrijk kenmerk van de voetafdruk is dat beperkte blootstelling aan de sonde (bijvoorbeeld 'single-hit kinetiek') resulteert in de uniforme bemonstering van elke nucleotide van het polymeer. ⁵

In deze video artikel, gebruiken we de P4-P6 domein van de Tetrahymena ribozym om RNA-monstervoorbereiding en het bepalen van een Mg (II)-gemedieerde vouwen isothermen illustreren. We beschrijven het gebruik van de bekende hydroxylradicaal footprinting protocol dat H ₂ O ₂ (we noemen dit de 'peroxidative "protocol) en een waardevol, maar niet algemeen bekend, alternatief, dat van nature opgeloste O ₂ gebruikt (we noemen dit vereist het' oxidatieve 'protocol). Een overzicht van de datareductie, transformatie-en analyseprocedures wordt gepresenteerd.

Protocol

1. De voorbereiding van Footprinting reagentia

1. Bereid een 10x reactie buffer met 100 mM natrium cacodylate, 1 mM EDTA, en 1 M KCl. Stel de pH op 7,4. Filter de buffer met behulp van een 0,2 uM acetaat filter apparaat (Nalgene). Opmerking: niet pipet rechtstreeks in de RNA 10x buffer.
2. Bereid de titratie reactie mix voor elke reactie, zoals aangegeven in tabel 1. Het volume van de titratie mix (1x buffer en Mg (II) in de gewenste concentratie) moet 90 ul worden, voordat je 10μl van RNA in 1x buffer.
3. Bereid een RNAse T1 spijsvertering buffer met 6.63M Ureum, 20mm natriumcitraat, 1 mM EDTA, 0,25 ug / ul tRNA, 0,025% xyleen cyanol, en 0,025%....

Discussion

Hydroxyl radicaal voetafdruk is een waardevol instrument om het oplosmiddel toegankelijke oppervlakte van nucleïnezuren te beoordelen. Kwalitatieve en kwantitatieve vorming van tertiaire structuur ¹⁴ kan worden gevolgd als een functie van parameters zoals ion type en de concentratie, pH, temperatuur, bindende eiwitten of vouwen co-factoren. De uitstekende combinatie van een straight forward en goedkoop protocol en de daaruit voortvloeiende oplosmiddel toegankelijkheid en vouwen informatie op een single-nucleo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Cat#
Sodium Cacodylate(Caution! Toxic)	Sigma-Aldrich	C4945-25g
EDTA (0.5 M)	Ambion	AM9260G
DEPC treated water	Ambion	AM9915G
Sodium Acetate (3 M)	Ambion	AM9740
MgCl2 (1 M)	Ambion	AM9530G
Urea	Ambion	AM9902
Sodium Citrate	Sigma-Aldrich	W302600
tRNA	Sigma-Aldrich	R-7876
Sodium-L-ascorbate	Sigma-Aldrich	A7631-25g
Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O	Sigma-Aldrich	F1543-500g
RNase T1	Fermentas	EN0541
Hydrogen Peroxide (30%)	Sigma-Aldrich	349887