Monitoring Equilibrium veranderingen in RNA structuur door 'Peroxidative' en 'Oxidatieve' hydroxyl radicaal Footprinting

Summary

Dit protocol beschrijft hoe het kwantificeren van de Mg (II)-afhankelijke vorming van RNA tertiaire structuur door twee methoden van hydroxyl-radicaal voetafdruk.

Abstract

RNA-moleculen spelen een essentiële rol in de biologie. Naast het overbrengen van genetische informatie, kan RNA vouwen in unieke tertiaire structuren vervullen van een specifieke biologische rol als regelgever, bindmiddel of katalysator. Informatie over de tertiaire formatie contact is essentieel voor de functie van RNA-moleculen te begrijpen. Hydroxyl-radicalen (• OH) zijn uniek probes van de structuur van nucleïnezuren vanwege hun hoge reactiviteit en de geringe afmetingen. ¹ Bij gebruik als een footprinting probe, hydroxyl-radicalen kaart het oplosmiddel bereikbare buitenzijde van het fosfodiester ruggengraat van DNA en RNA ^{een 2} met zo fijn als single nucleotide resolutie. Hydroxyl radicaal footprinting kan worden gebruikt om de nucleotiden in een intermoleculaire contact oppervlak, bijvoorbeeld in DNA-eiwit ¹ en RNA-eiwit complexen te identificeren. Evenwicht ³ en kinetische ^vier overgangen kan worden bepaald door het uitvoeren van hydroxyl radicaal footprinting als een functie van een solutiop variabele of tijd, respectievelijk. Een belangrijk kenmerk van de voetafdruk is dat beperkte blootstelling aan de sonde (bijvoorbeeld 'single-hit kinetiek') resulteert in de uniforme bemonstering van elke nucleotide van het polymeer. ⁵

In deze video artikel, gebruiken we de P4-P6 domein van de Tetrahymena ribozym om RNA-monstervoorbereiding en het bepalen van een Mg (II)-gemedieerde vouwen isothermen illustreren. We beschrijven het gebruik van de bekende hydroxylradicaal footprinting protocol dat H ₂ O ₂ (we noemen dit de 'peroxidative "protocol) en een waardevol, maar niet algemeen bekend, alternatief, dat van nature opgeloste O ₂ gebruikt (we noemen dit vereist het' oxidatieve 'protocol). Een overzicht van de datareductie, transformatie-en analyseprocedures wordt gepresenteerd.

Protocol

1. De voorbereiding van Footprinting reagentia

1. Bereid een 10x reactie buffer met 100 mM natrium cacodylate, 1 mM EDTA, en 1 M KCl. Stel de pH op 7,4. Filter de buffer met behulp van een 0,2 uM acetaat filter apparaat (Nalgene). Opmerking: niet pipet rechtstreeks in de RNA 10x buffer.
2. Bereid de titratie reactie mix voor elke reactie, zoals aangegeven in tabel 1. Het volume van de titratie mix (1x buffer en Mg (II) in de gewenste concentratie) moet 90 ul worden, voordat je 10μl van RNA in 1x buffer.
3. Bereid een RNAse T1 spijsvertering buffer met 6.63M Ureum, 20mm natriumcitraat, 1 mM EDTA, 0,25 ug / ul tRNA, 0,025% xyleen cyanol, en 0,025% broomfenolblauw. Deze buffer kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 6 maanden.
4. De Fenton reactie vereist vers bereide waterige oplossingen van 250 mM Fe (NH _{4) 2} (SO _{4) 2,} 250 mM EDTA en 500 mM natrium-L-ascorbaat. De concentraties vermeld in hoofdstuk 10,5 zijn optimaal voor evenwicht experimenten in buffer zoals natrium cacodylate die niet scharrelen radicalen en diverse tweewaardige ion concentraties.
5. Reagentia voor de peroxidative (1.5.1) en oxidatieve (1.5.2) voetafdruk reactie.
   1. De peroxidative Fenton reactie vereist een vers bereide waterige oplossingen van 100 mM Fe-EDTA-oplossing, en 50 mM natrium-L-ascorbaat en 1,5% H ₂ O _2. De Fe-EDTA-oplossing wordt bereid door het mengen van Fe (NH _{4) 2} (SO _{4) 2} met EDTA tot 1,1 keer meer dan EDTA dan ijzer hebben.
   2. Net voor de inleiding van de oxidatieve splitsingsreactie (3.4.2), maakt de Fenton reactie mix door het combineren van 2 pi van Fe (NH _{4) 2} (SO _{4) 2} (250 mm), 2,2 ul van EDTA (250 mm), 62,5 pl natrium-L-ascorbaat (500 mm), 22,5 ul 10x reactiebuffer en 135,5 ul van H ₂ O tot de uiteindelijke concentraties te bereiken in het footprinting reactiemengsel (3.4.2) van 0.10 mM, 0,11 mM en 6,61 mM, respectievelijk.

2. RNA Voorbereiding voor Footprinting Experiment

1. RNA kan worden geproduceerd door standaard in vitro transcriptie van DNA-templates ⁶ of, indien korter dan 50 nucleotiden, worden gekocht (bijv. bij Integrated DNA Technologies, www.idtdna.com). Volg de aanbevolen laboratorium netheid procedures om te proeven integriteit van RNA te houden tijdens footprinting experimenten. ⁷
2. Defosforylering ⁸ van in-vitro getranscribeerde RNA nodig is voor het ³² P de etikettering van het 5 'uiteinde van RNA. 10 pmol van RNA zijn eind-gelabeld door kinasing. ⁹ De oplossing moet troebel worden na een succesvolle inactivatie van fosfatase.
3. Zuiver radioactief gelabelde RNA met behulp van denaturerende gelelektroforese. Het RNA wordt teruggewonnen door twee latere gel extractie met behulp van 0,3 M natriumacetaat (pH 5,5). RNA wordt neergeslagen door het mengen van 0,5 ml waterige oplossing met 1 ml ethanol en de daaropvolgendeincubatie gedurende 1 minuut op droog ijs. Spin monster bij 4 ° C, 12500 rpm voor 0,5 uur. Verwijder het supernatant en was RNA pellet met 70% ethanol. Verwijder de bovenstaande vloeistof extra centrifugeren en droge pellet in vacuüm.
4. Los van de ³² P-gelabelde RNA monsters in 330 ul van 1x Buffer.Pipet 30 ul van de RNA-oplossing in een reageerbuis, neerslag met ethanol en droog RNA in vacuüm, houden deze buis voor het genereren van de referentie-ladder (stap 3.5). Denatureren de gebufferde RNA-oplossing door verhitting bij 95 ° C gedurende 2 minuten. Koel de monsters op kamertemperatuur gedurende 15 minuten en geven een snelle draai naar beneden te brengen van de condenseert op de deksels van de buizen terug in oplossing.

3. De Footprinting Experiment

1. De electroforese kam bepaalt het maximum aantal datapunten per analytische gel. We maken gebruik van een 30 goed kam. De verwijzing ladder bezet twee putten en het niet-geknipte controle een. Bereid 27 reactie buizen. De laatste Mg (II) concentrations moet gelijkmatig worden gespreid op een logaritmische schaal verspreid over ordes van grootte rond de titratie midden.
2. Afzonderlijk, incubeer het RNA en de Mg (II)-oplossingen bij 50 ° C gedurende 5 minuten. Mix 10 ul van RNA-oplossing met 90 ul van het overeenkomstige bedrag van de Mg (II) in 1x buffer tot een eindvolume van 100 ui te komen. Incubeer de oplossingen gedurende 30 minuten bij 50 ° C.
3. Laat de oplossingen equilibreren bij 25 ° C gedurende 1 uur tijdens het vouwen optreedt.
4. Peroxidative (3.4.1) of oxidatieve (3.4.2) hydroxylradicaal voetafdruk reactie.
   1. Start de peroxidative reactie door het plaatsen van druppeltjes van 2 pi Fe-EDTA (100 mm), 2 pi natrium-L-ascorbaat (50 mm) en 2 pi H ₂ O ₂ (1,5%) van elkaar gescheiden aan de bovenkant binnenkant van de reactie buis die de RNA-oplossing en start de footprinting reactie door krachtig mengen. Stop de reactie na 15 seconden door de toevoeging van 300 ul koud absolute ethanol. Zet de buizen 3-5 keer. Neerslag, wassen endroog de pellet als in stap 2.4.
   2. Start de oxidatieve hydroxylradicaal footprintingreaction door toevoeging van 5 ul van de vers bereide Fenton reactie mix (1.6). Incubeer gedurende 30 minuten bij 25 ° C. Voeg 300 ul van koude absolute ethanol aan de reactie en meng door het draaien van de buizen 3-5 keer doven. Neerslag, was en droog de pellet, zoals aangegeven in stap 2.4.
5. Genereer een RNase T1 te verteren referentiemonsters volgens standaard procedures ¹⁰ met behulp van de bereide oplossing in stap 1.3.
6. Los RNA pellets in 8 ul gel geladen kleurstof II (Ambion) en bevestig RNA wordt geresuspendeerd met behulp van de geigerteller.
7. Bereid een denaturerende, 8% polyacrylamide sequencing gel volgens standaard protocollen. Load ¹¹ monsters met inbegrip van twee referenties en een controle. Aparte RNA-fragmenten bij 60 W - 75 W voor 2,5 uur. Expose gedroogde gel naar een opslagplaats fosforscherm 's nachts. Scan fosfor scherm met een imaging systeem voor filmloze autoradiografie, bijvoorbeeld. Storm 865 (GE Healthcare) of Typhoon (GE Healthcare). Transfer gel image bestand op uw computer.

4. Data Analysis

1. Het hydroxyl radicaal reactiviteit van elk nucleotide wordt bepaald door het kwantificeren van de intensiteit van elke band op de analytische gel. Downloaden, installeren en open SAFA, een makkelijk te open source software te gebruiken voor enkele band montage en kwantificering. ^{12, 13} Volg de handleiding instructies. Kortom, laadt u de RNA-sequentie als. Txt bestand, gevolgd door de gel beeld. Gel-bestand. Pas band intensiteiten, definieer de rijstroken, kiest u een anker rijstrook, en het uitvoeren van een gel uitlijning. Toewijzing van bands nucleotiden gebeurt met betrekking tot RNase T1 spijsvertering ladder. Kwantificeren van de band integralen en gebruik de normalisering / colorplot functie te normaliseren en wijs mogelijk invariant residuen. Sla de uitgang als een. Txt-bestand.
2. SAFA-uitgangen een spreadsheet met kolommen die rijstroken op de gel en rijen die de ingreerde band dichtheid van de individuele bands die overeenkomt met de RNA-fragment. De eerste, identificeren van de bescherming van sites die een merkbare verandering in solvent toegankelijkheid weer te geven door het vergelijken van de bescherming profiel afgeleid van de no Mg (II) monster met het profiel van het eindpunt Mg (II) concentratie (50 mM in ons voorbeeld). Hoe lager de waarde, hoe meer bescherming het nucleotide is tegen de aanval van hydroxyl radicalen en vice versa.
3. Maak vouwen isothermen van de genormaliseerde band integralen van individuele of groepen van nucleotiden versus Mg (II) concentratie. De isothermen zijn individueel geschaald naar fractionele verzadiging door fi = L + (U - L) • waarbij f de geïntegreerde dichtheid van de band (s) geeft wordt geanalyseerd, L en U vertegenwoordigt de onder-en bovengrens voor de overgang en is fractionele verzadiging. ¹⁴ De gegevens zijn geschikt een niet-lineair l met behulp vanoosten vierkante analyse programma (We gebruiken ofwel Origin (OriginLab) of GraphPad (GraphPad Software, Inc.)) naar de Hill vergelijking (1),
   
   waar K _d is het evenwicht dissociatieconstante, [M] komt overeen met de concentratie van de variabele die het vouwen reactie bemiddelt, Mg (II) in dit voorbeeld, en n _H is de Hill coëfficiënt. Deze procedure schalen de overgang naar fractionele verzadiging, bepaalt haar middelpunt en geeft een fenomenologische test van de vraag of een overgang is sigmoïdale. Isothermen afgeleid van sequentie-gels (Figuur 3A), die werden geanalyseerd door de SAFA (Figuur 3B) en monteer zoals hierboven beschreven zijn weergegeven in figuur 3C. De fractionele verzadiging isothermen weergegeven in figuur 3 werden gegenereerd door de schaal in een spreadsheet de waarden die door SAFA tegen de beste pasvorm onder-en bovengrenzen (U en L) met behulp van de vergelijking fractie = waarde / (U - L) - L / (U - L).

5. Representatieve resultaten:

Figuur 3 toont representatieve resultaten van P4-P6 RNA • OH voetafdruk experimenten. De gel afbeelding (links) geeft aan dat a) achtergrond decollete minimaal is (rechter rijbaan), b) single nucleotide opdracht is mogelijk door goed gedefinieerd bands in de T1-laan (RNase T1 splitst op elke G), en c) het hydroxyl radicaal geïnduceerde fragmentatie van RNA is ruim boven de achtergrond. De overgang van laag naar hoog Mg (II) is aangesloten bij afnemende geïntegreerde band dichtheid van individuele en groepen van banden met vermelding van de vorming van RNA tertiaire structuur. Enkele of groepen aaneengrenzende nucleotide waarvan decollete veranderingen gelijktijdig worden aangeduid als een 'bescherming'. De • OH beveiligingen kenmerk van de Mg (II) gemedieerde vouwing van de P4-P6 RNA sluiten nauw aan bij het ​​oplosmiddel ontoegankelijke gebieden van het molecuul waargenomen in de kristalstructuur. ¹⁵

Gevouwen RNA-moleculen c een zeer verschillende mate (dat wil zeggen, hoe dicht bij de achtergrond van de band dichtheden daling) van de tertiaire contact opnemen met de bescherming die nog niet zijn gecorreleerd met duidelijke structurele of dynamisch fenomeen. Zo zullen sommige RNA-moleculen tonen goed gedefinieerde structurele overgangen, zoals weergegeven in figuur 3, en sommige niet. Band intensiteiten zijn gekwantificeerd en genormaliseerd door de ^SAFA-12 analyse (Figuur 3B). De output is een 'thermische' plot het visualiseren van de relatieve mate van bescherming tegen • OH. De kleur overgang beschrijft de toegankelijkheid te wijzigen bij de Mg (II) toevoeging. Wit naar rood of blauw toont meer toegankelijk of meer beschermde nucleotiden, respectievelijk. Elke graad van de schaduw is verbonden met een numerieke waarde die kan worden uitgezet als een bescherming curve (Figuur 3C) en geanalyseerd door een model voor, zoals de Hill vergelijking (1). Het evenwicht dissociatieconstante aangesloten bij Protection 153-155 is ruwweg twee keer die van de overeenkomstige waarde van de bescherming 163-164.

NHOUD ">
Figuur 1. Hydroxyl radicaal productie-en P4-P6 RNA vouwen. A) Fe (II) katalyseert de vorming van hydroxyl-radicalen uit waterstofperoxide. Ascorbaat vermindert Fe (III) terug naar ferro-ijzer. B) Bij gebrek aan Mg (II), is geen P4-P6 tertiaire structuur gevormd, waardoor hydroxyl-radicalen door te dringen en hang allemaal toegankelijk ruggengraat posities. Toevoeging van de Mg (II) initieert vouwen van de P4-P6, zodat alleen het oplosmiddel toegankelijk ruggengraat te worden gesplitst door de hydroxyl radicalen.

Figuur 2. Schets van een hydroxyl radicaal voetafdruk experiment. A) Dephophorylation en ³² P 5'-uiteinde etikettering van RNA. B) Zuivering van ³² P-gelabelde RNA op een denaturerende polyacrylamide gel. C) Excisie van RNA band, de daaropvolgende RNA-extractie en ethanol precipitatie. D) Prefolding envouwen van RNA. E) Toevoeging van vers bereide Fenton reactiemengsel om de hydroxyl radicalen genereren. F) RNA fragment scheiding door denaturerende polyacrylamidegelelektroforese. G) Kwantificering van de RNA-fragmenten door de SAFA-software.

Figuur 3. Analyse van de RNA-fragmenten na peroxidative Fenton voetafdruk reactie. (A) Het RNA werd blootgesteld aan hydroxyl radicalen en de splitsing producten werden opgelost met behulp van denaturerende polyacrylamide gelelektroforese (PAGE). De foto toont peroxidative splitsingsproducten met een toenemende concentratie van Mg (II). Referentie-en rijstroken zijn gelabeld. Deze afbeelding is de input voor het SAFA-programma waarmee het volume van elke band quantitates. (B) De 'thermische' plot gegenereerd door SAFA. (C) Een spreadsheet van waarden in verband geïntegreerde band dichtheid aan nucleotide aantal output van SAFA is geanalyseerd door een model voor, zoals de Hill equatiop (1). Regio's van de bescherming werden gekozen op basis van de toename van de band integrale dichtheid als een functie van Mg (II) concentratie. De K _d is de Mg (II) concentratie waarbij de helft van het RNA is gevouwen op de site wordt gecontroleerd. The Hill coëfficiënt, n _H, is een maat voor de helling van de curve, die informatie geeft over de binding coöperativiteit en zorgt voor een lagere schatting voor het aantal van magnesium-ionen die betrokken zijn bij het ​​vouwen van deze bijzondere site.

Tabel 1. Vertegenwoordiger volumes voor het genereren van RNA-monsters met verschillende Mg (II) concentraties.

Discussion

Hydroxyl radicaal voetafdruk is een waardevol instrument om het oplosmiddel toegankelijke oppervlakte van nucleïnezuren te beoordelen. Kwalitatieve en kwantitatieve vorming van tertiaire structuur ¹⁴ kan worden gevolgd als een functie van parameters zoals ion type en de concentratie, pH, temperatuur, bindende eiwitten of vouwen co-factoren. De uitstekende combinatie van een straight forward en goedkoop protocol en de daaruit voortvloeiende oplosmiddel toegankelijkheid en vouwen informatie op een single-nucleo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam	Bedrijf	Cat#
Sodium Cacodylate(Let op! Toxisch)	Sigma-Aldrich	C4945-25g
EDTA (0.5 M)	Ambion	AM9260G
DEPC behandeld water	Ambion	AM9915G
Sodium Acetaat (3 M)	Ambion	AM9740
MgCl2 (1 M)	Ambion	AM9530G
Urea	Ambion	AM9902
Sodium Citraat	Sigma-Aldrich	W302600
tRNA	Sigma-Aldrich	R-7876
Natrium-L-ascorbinezuur	Sigma-Aldrich	A7631-25g
Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O	Sigma-Aldrich	F1543-500g
RNase T1	Fermentas	EN0541
Waterstofperoxide (30%)	Sigma-Aldrich	349887