Het uitvoeren van op maat MicroRNA microarray experimenten

Summary

Een eenvoudige procedure van het uitvoeren van op maat microRNA microarray experimenten beschreven. De stappen omvatten het isoleren van RNA, etikettering RNA en DNA, het hybridiseren van het monsters microarrays, het scannen van de microarrays, kwantificeren en analyseren van hybridisatie signalen.

Abstract

microRNAs (miRNAs) zijn een grote familie van ~ 22 nucleotiden (nt) lange RNA-moleculen die op grote schaal worden uitgedrukt in ^een eukaryoten. Complex genomen coderen minstens honderden miRNAs, die vooral remmen de expressie van een groot aantal van target genen post-transcriptioneel ^{2, 3.} miRNAs controle een breed scala van biologische processen ^1. Daarnaast heeft veranderd miRNA expressie in verband gebracht met menselijke ziekten zoals kanker, en miRNAs kunnen dienen als biomarkers voor ziekten en prognose ^{4, 5.} Het is daarom belangrijk te begrijpen van de expressie en functies van miRNAs onder diverse omstandigheden.

Drie belangrijke benaderingen zijn gebruikt om het profiel van miRNA expressie: real-time PCR, microarray, en diepe sequencing. De techniek van miRNA microarray heeft het voordeel dat high-throughput, over het algemeen minder duur, en de meeste van de experimentele en de analyse stappen kunnen worden carrIED in een moleculaire biologie laboratorium bij de meeste universiteiten, medische faculteiten en de bijbehorende ziekenhuizen. Hier beschrijven we een methode voor het uitvoeren van op maat miRNA microarray experimenten. Een miRNA probe set zal worden afgedrukt op glas dia's miRNA microarrays te produceren. RNA is geïsoleerd met behulp van een methode of reagens dat kleine RNA-soorten jam, en vervolgens voorzien van een fluorescentie kleurstof. Als een controle, zijn DNA-oligonucleotiden die overeenkomen met een subset van miRNAs ook gelabeld met een andere fluorescentie kleurstof. De referentie-DNA zal dienen om de kwaliteit van de dia-en hybridisatie aan te tonen en zal ook gebruikt worden voor data normalisatie. Het RNA en DNA zijn gemengd en gehybridiseerd aan een microarray slide met probes voor het grootste deel van de miRNAs in de database. Na het wassen is de dia gescand om beelden te verkrijgen, en intensiteiten van de individuele plekken gekwantificeerd. Deze ruwe signalen zullen verder worden verwerkt en geanalyseerd als de expressie data van de overeenkomstige miRNAs. Microarray dia's kunnen worden gestript en geregenereerd om de kosten van microarrays te verminderen en de consistentie van microarray experimenten te verbeteren. Dezelfde principes en procedures zijn van toepassing op andere vormen van custom microarray experimenten.

Protocol

1. Afdrukken van aangepaste miRNA microarrays

1. Druk de microarray dia's met behulp van de microarray kern van facilitaire diensten aan een universiteit of een bedrijf. De kwaliteit van de microarray fabricage is een van de meest kritische factoren voor het succes van een microarray experiment. Probeer een paar diensten, indien mogelijk. Idealiter zou een afdruk 50-100 dia's in een tijd, en alle dia's eruit zal zien identiek, met goed gescheiden, individuele plekken.
2. Voor microarray-ondersteuning, gebruiken we de GAPS II gecoate dia's.
3. Voor miRNA probes, gebruiken we de nCode multi-species miRNA Microarray Probe V2 Set.

Discussion

Ondanks de recente ontwikkelingen in de diepe sequencing technologie, micro-array nog steeds een levensvatbare keuze voor high-throughput analyse van DNA en RNA. In vergelijking met diepe sequencing, microarray experimenten zijn goedkoper, en een typische moleculaire biologie laboratorium kan de meeste van de experimenten en data-analyse in huis, die zorgt voor flexibiliteit en bespaart tijd. In de toekomst, microarrays zijn waarschijnlijk zeer geschikt om intensief te ondervragen sets van genen, bijvoorbeeld, kan alle .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Items	Verkoper	Catalogus nummer	Reacties
NCode meerdere soorten miRNA Microarray Probe Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Ontworpen op basis van de miRBase versie 9.0 (oktober 2006). Het bevat ~ 1140 ongewijzigd, 34-44 nt lang oligonucleotiden als probes voor de worm, vlieg, zebravis, muis, rat, en menselijke miRNAs, en een aantal van de interne controle sondes, zoals snoRNAs. De miRNA sondes zijn doubletten van de sequenties complementair aan volwassen miRNAs, vandaar de grootte van ~ 44 nt. Voor de analyse kan men zich richten op miRNAs uit een bepaald genoom (s) van belang.
TRIzol	Invitrogen	15596018	We hebben ook verrijkt, kleine RNA-fractie voor de etikettering, hoewel de totale RNA monsters zijn sneller en gemakkelijker te bereiden en te kwantificeren en geschikt voor downstream-toepassingen zoals mRNA-analyse.
T4 RNA-ligase een	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit	Invitrogen	U21660	Deze kit of soortgelijke producten kunnen worden gebruikt voor experimentele RNA monsters of een controle RNA (in plaats van controle DNA) label ook.
5'-PCU-DY547-3 '	Dharmacon	Op maat gemaakt	Kleine RNA-fractie kan op dezelfde manier worden gelabeld door ligatie.
CentriSep columns	Princeton Scheidingen	CS-901
GAPSII gecoat slide	Corning	40004	Andere soorten van dia's kunnen ook worden gebruikt.
Microarray hybridisatie kamers	Corning	2551 of 40.080	Andere soorten van hybridisatie kamers en dekglaasjes zou ook moeten werken. Met behulp van commercieel beschikbare hybridisatie machines kunnen verminderen hybridisatie tijd aanzienlijk, bijvoorbeeld om ~ 2 uur.
Lifterslips	ThErmo / Erie Scientific	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent