Het uitvoeren van op maat MicroRNA microarray experimenten

Samenvatting

Een eenvoudige procedure van het uitvoeren van op maat microRNA microarray experimenten beschreven. De stappen omvatten het isoleren van RNA, etikettering RNA en DNA, het hybridiseren van het monsters microarrays, het scannen van de microarrays, kwantificeren en analyseren van hybridisatie signalen.

Samenvatting

microRNAs (miRNAs) zijn een grote familie van ~ 22 nucleotiden (nt) lange RNA-moleculen die op grote schaal worden uitgedrukt in ^een eukaryoten. Complex genomen coderen minstens honderden miRNAs, die vooral remmen de expressie van een groot aantal van target genen post-transcriptioneel ^{2, 3.} miRNAs controle een breed scala van biologische processen ^1. Daarnaast heeft veranderd miRNA expressie in verband gebracht met menselijke ziekten zoals kanker, en miRNAs kunnen dienen als biomarkers voor ziekten en prognose ^{4, 5.} Het is daarom belangrijk te begrijpen van de expressie en functies van miRNAs onder diverse omstandigheden.

Drie belangrijke benaderingen zijn gebruikt om het profiel van miRNA expressie: real-time PCR, microarray, en diepe sequencing. De techniek van miRNA microarray heeft het voordeel dat high-throughput, over het algemeen minder duur, en de meeste van de experimentele en de analyse stappen kunnen worden carrIED in een moleculaire biologie laboratorium bij de meeste universiteiten, medische faculteiten en de bijbehorende ziekenhuizen. Hier beschrijven we een methode voor het uitvoeren van op maat miRNA microarray experimenten. Een miRNA probe set zal worden afgedrukt op glas dia's miRNA microarrays te produceren. RNA is geïsoleerd met behulp van een methode of reagens dat kleine RNA-soorten jam, en vervolgens voorzien van een fluorescentie kleurstof. Als een controle, zijn DNA-oligonucleotiden die overeenkomen met een subset van miRNAs ook gelabeld met een andere fluorescentie kleurstof. De referentie-DNA zal dienen om de kwaliteit van de dia-en hybridisatie aan te tonen en zal ook gebruikt worden voor data normalisatie. Het RNA en DNA zijn gemengd en gehybridiseerd aan een microarray slide met probes voor het grootste deel van de miRNAs in de database. Na het wassen is de dia gescand om beelden te verkrijgen, en intensiteiten van de individuele plekken gekwantificeerd. Deze ruwe signalen zullen verder worden verwerkt en geanalyseerd als de expressie data van de overeenkomstige miRNAs. Microarray dia's kunnen worden gestript en geregenereerd om de kosten van microarrays te verminderen en de consistentie van microarray experimenten te verbeteren. Dezelfde principes en procedures zijn van toepassing op andere vormen van custom microarray experimenten.

Protocol

1. Afdrukken van aangepaste miRNA microarrays

1. Druk de microarray dia's met behulp van de microarray kern van facilitaire diensten aan een universiteit of een bedrijf. De kwaliteit van de microarray fabricage is een van de meest kritische factoren voor het succes van een microarray experiment. Probeer een paar diensten, indien mogelijk. Idealiter zou een afdruk 50-100 dia's in een tijd, en alle dia's eruit zal zien identiek, met goed gescheiden, individuele plekken.
2. Voor microarray-ondersteuning, gebruiken we de GAPS II gecoate dia's.
3. Voor miRNA probes, gebruiken we de nCode multi-species miRNA Microarray Probe V2 Set.
4. Los van alle oligonucleotiden in 3 x SSC bij 10 uM en quadruply printen ze uit op de dia's. Bevestig de dia's door de ultraviolette straling volgens de instructies voor de GAAPS II dia's. Label de dia met een diamant pen naar het gebied en aan de zijkant met de bedrukte sondes te markeren. Bewaren bij 22 ° C.

2. Monstervoorbereiding

1. Elke methodeof reagens kunnen worden gebruikt om RNA te isoleren, zolang het maar kleine RNA's bewaart. We gebruiken over het algemeen TRIzol (Invitrogen) aan de totale RNA-extract, met voldoende kwaliteit en kwantiteit van RNA preparaten, zoals gemeten door A _260nm en _280nm A lezingen.
2. Voor RNA-etikettering, mix ~ 25 pg totaal RNA met 0,5 ug van 5'-PCU-DY547-3 ^'6 in 1 x buffer (50 mM HEPES, pH 7,8, 20 mM _MgCl2, 10 ug / ml BSA, 10% DMSO) met ~ 20 eenheden T4 RNA-ligase 1, aangevuld met ~ 10 mM DTT en ~ 0,02-0,03 laatste deel van de 10 x T4 RNA-ligase een buffer voor ATP.
3. Laat etikettering om door te gaan op het ijs in een koelkast voor 2-24 uur. Neerslag RNA met 0,3 M natriumacetaat en drie volumes ethanol. Voor een efficiënte ligatie en neerslag, te ontbinden totaal RNA meer dan 2 mg / ml, en houd het totale ligatie volume op ~ 20 ul.
   1. Als er minder RNA beschikbaar is, het bedrag van de voorbelasting RNA en 5'-PCU-DY547-3 'kan worden verlaagd.
   2. Als het RNA is zeer verdunde, voeg drager zoals gist tRNA om te helpen bij neerslag.
4. Combineer en label in totaal 1 ug van DNA-oligonucleotiden die overeenkomen met een subset van zoogdieren miRNAs het gebruik van de Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit ⁶ als een controle voor de hybridisatie proces. Zuiver het gelabelde DNA met behulp van een CentriSep kolom en op te slaan in het donker bij -20 ° C.

3. Microarray hybridisatie

1. Voor het gebruik van de dia's voor de eerste keer, de dia's pre-hybridiseren in een gefilterde oplossing van 3 x SSC, 0,1% SDS, 0,2% BSA gedurende 30-60 minuten bij 37 ° C. Dompel ze in het water een paar keer, dan in isopropanol. Droog de glaasjes met behulp van een centrifuge met een dia-adapter bij 100 g gedurende 5 minuten bij 22 ° C.

Opmerking: Wij gebruiken Corning microarray hybridisatie kamers en Erie Scientific mSeries van Lifterslips om microarray hybridisatie uit te voeren.

2. Spoel de lifterslips in het water, dan in ethanol, voor het drogen in de lucht. Plaats een dia in een microarray hybridisatie kamer basis, en een lifterslip op de top van de dia. De lifterslip zal betrekking hebben op de sonde gebied, met zijn witte strips contact opnemen met de slide.
3. In het donker, spin down van de neergeslagen, gelabeld RNA. Een keer wassen met 70% ethanol, en de lucht droog de pellet. De pellet moet worden roodachtig.
4. Bereid een hybridisatie-oplossing met 400 mM Na ₂ HPO ₄ pH 7,0, 0,8% BSA, 5% SDS, 12% formamide ⁶ met 1/15-1/100 ul van het gezuiverde, gelabeld DNA-(2,4) per RNA monster. De hoeveelheid toegevoegde verwijzing DNA hangt af van hoeveel verschillende oligonucleotiden zijn gelabeld (2.4). Als er meer dan 100, zijn er minder verdunning nodig is.
5. Lossen goed op de RNA-pellet met ~ 60 ul van de hybridisatie-oplossing.
6. Voeg 20 ul van het water aan elk van de bevochtigen putten in het Corning microarray hybridisatie kamer basis.
7. Voeg toe tHij mengsel van gelabelde RNA en DNA aan de dia. Gebruik een dunne pipet tip, zachtjes tegen de rand van de lifterslip, en laat de oplossing voor de ruimte tussen de lifterslip en schuif door de zuigkracht in te voeren.
8. Plaats het deksel van hybridisatie over de basis, dan sluit de kamer met metalen clips.
9. Zet de hele kamer in de plastic zak die bij de kamer cassette van Corning.
10. Plaats de kamer cassette (s) in een container met natte papieren handdoek; deksel van de container af met plasticfolie en plaats deze in een 37 ° C vochtig, celkweek incubator voor ~ 24 uur. Deze voorzorgsmaatregelen (3.6, 3.9, 3.10) ervoor zorgen dat de hybridisatie-oplossing niet uitdrogen tijdens de incubatie.

4. Post-hybridisatie verwerking

1. Demonteer de kamer cassettes een voor een. Dompel een glijbaan en de lifterslip in 2 x SSC bij 22 ° C. De lifterslip zal natuurlijk vallen de dia. Plaats deze in 0,8 x SSC. Wassende dia's in 0,8 x SSC twee keer, toen drie keer in 0,4 x SSC, 1-2 min in totaal. Droog de glaasjes met behulp van een centrifuge met een dia-adapter. Was de lifterslips met water en later op te slaan voor hergebruik.
2. Scan de dia's met een geschikte scanner, bijvoorbeeld, de Perkin Elmer ScanArray 5000 of Molecular Devices Axon GenePix 4000B microarray scanner. Scannen op golflengten dicht bij de 547 nm en 647 nm op de bijbehorende beeldbestanden te krijgen.
3. Gebruik programma's zoals BlueFuse om pixel intensiteiten kwantificeren in de input-, beeld-bestanden van 4.2). Inspecteer de individuele spots met het programma om abnormale vlekken op de micro-arrays van verdere beschouwing te sluiten. Deze abnormale vlekken ontstaan ​​gewoonlijk uit een slechte foto afdrukken of foto manipulatie na hybridisatie.
4. Gebruik programma's zoals GeneSpring en Excel voor data-analyse en presentatie. Algemene overwegingen voor microarray data normalisatie toe te passen, dat buiten het bestek van dit paper.
5. Zodra voldoende signalen worden verkregen after 4,3), strip de microarray dia's voor hergebruik ^7. Spoel de dia's in het water, daarna onder te dompelen in voorverwarmde, 1 mM NaOH en 0,1 x SSC in een kleuring schotel op 62 ° C gedurende 10-20 minuten. Herhaal de incubatie. Was de dia's een paar keer in het water tot 60 minuten zachtjes schudden bij 22 ° C. Droog de glaasjes met behulp van een centrifuge, en sla bij 22 ° C.
6. Voor het gebruik van de geregenereerde dia's, is het niet nodig om opnieuw pre-hybridiseren ze. Gewoon was ze in het water, gevolgd door isopropanol, en droog de dia's vlak voor hybridisatie.

5. Representatieve resultaten:

We hebben grotendeels de beschreven procedures die worden gevolgd aan de mondiale miRNA expressie profiel in duizenden monsters, dat wil zeggen, RNA geïsoleerd van zebravissen naar menselijk specimen onder diverse omstandigheden. Figuur 1 toont een gescand beeld van een microarray tot zeer nauwkeurig en sterke hybridisatie signalen te tonen op de glijbaan. De Pearson correlatiop de coëfficiënten tussen technische replica van microarray hybridisatie zijn ~ 0.99 ^7, wat aangeeft een uitstekende reproduceerbaarheid.

Figuur 1 Composite beeld van een gescande miRNA microarray dia na hybridisatie. Rode vlekken het gevolg van kruisingen door de referentie-DNA, groene vlekken van de DY547-gelabelde RNA-monster, terwijl de gele plekken waren van hybridisaties door zowel het DNA en RNA naar dezelfde sondes.

Discussie

Ondanks de recente ontwikkelingen in de diepe sequencing technologie, micro-array nog steeds een levensvatbare keuze voor high-throughput analyse van DNA en RNA. In vergelijking met diepe sequencing, microarray experimenten zijn goedkoper, en een typische moleculaire biologie laboratorium kan de meeste van de experimenten en data-analyse in huis, die zorgt voor flexibiliteit en bespaart tijd. In de toekomst, microarrays zijn waarschijnlijk zeer geschikt om intensief te ondervragen sets van genen, bijvoorbeeld, kan alle ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Items	Verkoper	Catalogus nummer	Reacties
NCode meerdere soorten miRNA Microarray Probe Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Ontworpen op basis van de miRBase versie 9.0 (oktober 2006). Het bevat ~ 1140 ongewijzigd, 34-44 nt lang oligonucleotiden als probes voor de worm, vlieg, zebravis, muis, rat, en menselijke miRNAs, en een aantal van de interne controle sondes, zoals snoRNAs. De miRNA sondes zijn doubletten van de sequenties complementair aan volwassen miRNAs, vandaar de grootte van ~ 44 nt. Voor de analyse kan men zich richten op miRNAs uit een bepaald genoom (s) van belang.
TRIzol	Invitrogen	15596018	We hebben ook verrijkt, kleine RNA-fractie voor de etikettering, hoewel de totale RNA monsters zijn sneller en gemakkelijker te bereiden en te kwantificeren en geschikt voor downstream-toepassingen zoals mRNA-analyse.
T4 RNA-ligase een	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit	Invitrogen	U21660	Deze kit of soortgelijke producten kunnen worden gebruikt voor experimentele RNA monsters of een controle RNA (in plaats van controle DNA) label ook.
5'-PCU-DY547-3 '	Dharmacon	Op maat gemaakt	Kleine RNA-fractie kan op dezelfde manier worden gelabeld door ligatie.
CentriSep columns	Princeton Scheidingen	CS-901
GAPSII gecoat slide	Corning	40004	Andere soorten van dia's kunnen ook worden gebruikt.
Microarray hybridisatie kamers	Corning	2551 of 40.080	Andere soorten van hybridisatie kamers en dekglaasjes zou ook moeten werken. Met behulp van commercieel beschikbare hybridisatie machines kunnen verminderen hybridisatie tijd aanzienlijk, bijvoorbeeld om ~ 2 uur.
Lifterslips	ThErmo / Erie Scientific	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent