Methodenartikel

Een methode voor het labelen van bloedvaten in Embryonic Muizen

DOI:

10.3791/3267

⸱

7 oktober 2011

 ,  , 
1Department of Cellular Biology, University of Georgia, 2Centre for Immunology and Infection, Department of Biology and HYMS, University of York, 3Department of Genetics, University of Georgia

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft een methode voor het labelen van embryonale huid en thymus bloedvaten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De oprichting van een functioneel bloedvat-netwerk is een essentieel onderdeel van organogenese, en is noodzakelijk voor een optimale orgaanfunctie. Bijvoorbeeld, in de thymus juiste vaatstelsel vorming en patroonvorming is essentieel voor thymocyt toegang tot het orgel en de mature T-cel uitgang naar de periferie. De ruimtelijke ordening van de bloedvaten in de thymus is afhankelijk van signalen uit de lokale micro-omgeving, namelijk de thymus epitheelcellen (TEC). Diverse recente rapporten suggereren dat verstoring van deze signalen leidt tot thymus bloedvat gebreken 1,2. Eerdere studies hebben beschreven technieken die gebruikt worden om de neonatale en volwassen thymus bloedvaten 1,2 label. We zien hier een techniek voor de etikettering de bloedvaten in de embryonale thymus. Deze methode combineert het gebruik van de FITC-dextran of Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B 4) gezichts-ader injecties en CD31 antilichaam kleuring om thymus vasculaire structuren en PDGFR-β aan thymus perivasculaire mesenchym 3-5 label te identificeren. De optie van het gebruik van vriescoupes of vibratome secties is ook voorzien. Dit protocol kan worden gebruikt om de thymus vasculaire defecten, wat essentieel is voor het definiëren van de rol van TEC-afgeleide moleculen in thymus bloedvatvorming te identificeren. Als de methode labels van de gehele vaatstelsel, het kan ook gebruikt worden om de vasculaire netwerken te analyseren in meerdere organen en weefsels in het hele embryo inclusief huid en hart 6-10.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fluoresceïne gelabelde dextran en GSL I-isolectin B 4 gezicht ader injecties om embryonale vasculatuur label

  1. Bereid FITC-dextran (50ug/mL) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of GSL 1 - isolectin B 4 (20ug/200uL) in PBS in een 1,5 ml Eppendorf buis en warm tot 37 ° C. Voeg 100uL op voorraad 1.25mm snel groen / PBS om de FITC-dextran-oplossing (totaal volume 1 ml) en 180uL voorraad 1.25mm snel groen / PBS om de GSL 1 - isolectin B 4 (totaal volume 200uL), zodat de oplossing is zichtbaar blauw.
  2. Samen ontleden E14.5-E18.5 embryo's en dooierzak, waardoor het allantoïs steeltje (navelstreng slagader en ade....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Whole-mount en PECAM-1 (CD31) kleuring op de afdelingen zijn de conventionele methoden voor etikettering van het vaatstelsel in de embryonale muizen. Deze methoden vereisen het gebruik van directe en / of indirecte immunofluorescentie, en reinigingsmiddelen om de muis weefsel permeabilize. Dit blijkt een nogal tijdig proces. Hier hebben we in dienst FITC-dextran of isolectin B 4 gezicht ader injecties om direct het etiket van de embryonale vaatstelsel, zodat er geen vereiste voor antilichaam labeling stappen........

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidie ​​nummers R01AI055001 en R01AI082127 van NIAID naar NRM en SREB Proefschrift Fellowship Award aan JLB.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van het reagens Vennootschap Catalogus nummer
FITC-dextran Sigma FD150S-1G
Fluoresceïne gelabelde GSL 1 - isolectin B 4 Vector Laboratories FL-1201
Fast Green MP Biomedicals 195178
PFA Fluka 76240
Foetaal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550
Optimale Cutting Temperatuur Compound (OCT VWR 25608-930
Aceton JT Baker 9006-33
Donkey Serum Jackson 017-000-121
rat anti-muis CD31, BD Pharmingen 558736
geit anti-muis PDGFR-β R & D Systems AF1042
ezel anti-rat CD31 Alexa 647 (Invitrogen) Biolegend 102516
ezel anti-geit Alexa 594 (Invitrogen) Invitrogen A11058
Triton X -100 Sigma-Aldrich X-100
Low melt agarose / PBS Sigma-Aldrich A9414-25G
Methanol Fisher Scientific A413-4
Benzylalcohol Acros Wetenschappelijke 148390010
Benzylbenzoaat Acros Wetenschappelijke 105860010
Depressie dia's Fisher Scientific S175201
Fluorogel Electron Microscopy Sciences 17985-10
Dekglas (22x22) -1,5 Thermo Scientific 152222
Zeiss LSM 510 Meta confocale microscoop Zeiss
Micro ontleden tang Roboz RS-5135
Parafilm Nee OM992 Fisher Scientific 13-374-16
12 en 24 goed microplaten Evergreen Wetenschappelijke 222-8044-01F
Superfrost / Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
4 ml flacons duidelijk Nationale Wetenschappelijke B7800-2

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cuddihy, A. R. VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus. Blood. 113, 2723-2731 (2009).
  2. Muller, S. M. Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Embryonale muisvasculatuurinjectie in de gelaatsFITC dextran labelenGSL 1 isolectine B4CD31 antilichaamkleuringPDGFR beta perivasculaircryosectieprotocolvibratoomsectieconfocale microscopie imagingthymus vasculair onderzoek

Gerelateerde artikelen