Methodenartikel

Een methode voor het labelen van bloedvaten in Embryonic Muizen

DOI:

10.3791/3267

⸱

7 oktober 2011

 ,  , 
1Department of Cellular Biology, University of Georgia, 2Centre for Immunology and Infection, Department of Biology and HYMS, University of York, 3Department of Genetics, University of Georgia

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft een methode voor het labelen van embryonale huid en thymus bloedvaten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De oprichting van een functioneel bloedvat-netwerk is een essentieel onderdeel van organogenese, en is noodzakelijk voor een optimale orgaanfunctie. Bijvoorbeeld, in de thymus juiste vaatstelsel vorming en patroonvorming is essentieel voor thymocyt toegang tot het orgel en de mature T-cel uitgang naar de periferie. De ruimtelijke ordening van de bloedvaten in de thymus is afhankelijk van signalen uit de lokale micro-omgeving, namelijk de thymus epitheelcellen (TEC). Diverse recente rapporten suggereren dat verstoring van deze signalen leidt tot thymus bloedvat gebreken 1,2. Eerdere studies hebben beschreven technieken die gebruikt worden om de neonatale en volwassen thymus bloedvaten 1,2 label. We zien hier een techniek voor de etikettering de bloedvaten in de embryonale thymus. Deze methode combineert het gebruik van de FITC-dextran of Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B 4) gezichts-ader injecties en CD31 antilichaam kleuring om thymus vasculaire structuren en PDGFR-β aan thymus perivasculaire mesenchym 3-5 label te identificeren. De optie van het gebruik van vriescoupes of vibratome secties is ook voorzien. Dit protocol kan worden gebruikt om de thymus vasculaire defecten, wat essentieel is voor het definiëren van de rol van TEC-afgeleide moleculen in thymus bloedvatvorming te identificeren. Als de methode labels van de gehele vaatstelsel, het kan ook gebruikt worden om de vasculaire netwerken te analyseren in meerdere organen en weefsels in het hele embryo inclusief huid en hart 6-10.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fluoresceïne gelabelde dextran en GSL I-isolectin B 4 gezicht ader injecties om embryonale vasculatuur label

  1. Bereid FITC-dextran (50ug/mL) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of GSL 1 - isolectin B 4 (20ug/200uL) in PBS in een 1,5 ml Eppendorf buis en warm tot 37 ° C. Voeg 100uL op voorraad 1.25mm snel groen / PBS om de FITC-dextran-oplossing (totaal volume 1 ml) en 180uL voorraad 1.25mm snel groen / PBS om de GSL 1 - isolectin B 4 (totaal volume 200uL), zodat de oplossing is zichtbaar blauw.
  2. Samen ontleden E14.5-E18.5 embryo's en dooierzak, waardoor het allantoïs steeltje (navelstreng slagader en ader) intact.
  3. Transfer embryo's om een ​​nieuw gerecht Petrie (60 X 15 mm) en dompel hen in PBS bij kamertemperatuur.
  4. Positie van het embryo naar een sagittale uitzicht op het hoofd / gezicht te geven. Gebruik micro ontleden tang voor het embryo zachtjes greep aan het hoofd.
  5. Met behulp van een 30G naald injecteren 50uL FITC-dextran (50ug/mL) of GSL 1 - isolectin B 4 (20ug in 200uL PBS) in het gelaat ader wijst de naald naar de achterkant van het hoofd.
  6. Wanneer de kleurstof zichtbaar is in de navelstreng ader, verwijder de naald en scheiden het embryo van de allantoïs steeltje (arteria umbilicalis en ader).
  7. Na de injecties, laat embryo in PBS te blijven bij kamertemperatuur gedurende 2-3 minuten, zodat de kleurstof circuleert de hele embryo.

2. Whole-mount analyse van de huid vasculatuur

  1. Na aftrek van de kleurstof te laten circuleren in de hele embryo, verwijder de huid monsters uit de regio's van de ledematen, rug en buik, etc. 8,9.
  2. Was de huid monster in koude PBS, en vast te stellen 4% PFA / PBS gedurende 2 uur 8,9. Was drie keer voor 10 minuten elk in 4 ml flacon met 2 ml heldere koude PBS.
  3. Plaats huid monster op een objectglaasje en voeg 100 ul van montage media om elke dia en een afdekglas.
  4. Laat dia's te drogen in een donkere opslagruimte.
  5. Ga verder met twee 'Image Acquisition' sectie Step.

3. Multi-color etikettering van thymus en hart bloedvaten en perivasculaire cellen voor vriescoupes (Vervolg van deel 1, Stap 7)

  1. Hele embryo 'Flash bevriezen' in vloeibare stikstof. Embryo's kunnen worden en bewaard bij -80 ° C tot analyse.
  2. Als alternatief, ontleden uit thymus, spoelen in 4 ° C PBS, en vast te stellen 2 ml 4% paraformaldehyde (PFA) / PBS gedurende 2 uur. Was drie keer gedurende 10 minuten in koud PBS, plaats thymi in oktober, en vries en bewaar tot gebruik bij -80 ° C.
  3. Voor cryosectioning, verspreid LGO op 'blok' een sectie en monteren van de embryo of ontleed organen / weefsels voor het snijden.
  4. Snijd bevroren weefsel in 10 urn dikke secties en het verzamelen van op dia's.
  5. Fix secties in aceton gedurende 5-10 minuten. Was drie keer in koude TBS.
  6. Blok in 10% ezel serum / TBS in een vochtige kamer bij kamertemperatuur.
  7. Incubeer profielen voor een uur 's nachts-met 100 ul van de primaire antilichamen in een vochtige kamer bij 4 ° C: In dit voorbeeld gebruiken we rat anti-muis-CD31 (1:100) naar label endotheel, en de geit anti-muis PDGFR-β (1:100) naar perivasculaire cellen label. Het is nuttig om dia's te dekken met een individueel gesneden Parafilm strips om ervoor te zorgen dat het antilichaam gelijkmatig is verdeeld over de sectie.
  8. Na incubatie met het primaire antilichaam, wassen secties 3 keer in koude TBS. Incubeer met 100 ul van een passende secundaire antilichamen gedurende 30 minuten minimum.
  9. Was drie keer in koude TBS. Voeg 100 ul van de montage media om elke dia en een afdekglas.
  10. Laat dia's te drogen in een donkere opslagruimte.
  11. Ga verder naar sectie 'Image Acquisition'.

4. Multi-color etikettering van thymus bloedvaten en perivasculaire cellen voor vibratome secties (Vervolg van deel 1, Stap 7)

  1. Ontleden van zwezerik kwabben van de embryo en spoel met koud PBS.
  2. Fix zwezerik in 4% PFA / PBS bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
  3. Wassen in PBS-Triton X (0,15%) drie keer, 10 minuten en plaats thymi in een kleine plastic cartridge en onder te dompelen in 4% low melt agarose / PBS (~ 4 ° C). De thymus moet in contact komen met de onderkant van de cartridge.
  4. Laat agarose stollen op ijs (3-5 minuten). Gebruik een scheermesje af te snijden overtollige agarose. Voeg lijm op de vibratome blokkeren en houden monster het blok.
  5. Voeg koude PBS aan vibratome waterbad tot het monster en het blad worden ondergedompeld.
  6. Ingestelde snelheid en amplitude (hoge amplitude en lage gemiddelde snelheid is ideaal voor zachte thymus secties). De amplitude moet worden verminderd als secties breken als gevolg van teveel onrust.
  7. Snijd 50 um secties.
  8. Met behulp van een penseel, verzamelen secties in een 24-wells microtiterplaat in koude PBS.
  9. Blok secties in 500 pi van 10% ezel serum in PBS-Triton X (0,15%) voor 30 minuten.
  10. Incubeer secties voor 8 uur 's nachts met primaire antilichaam, zoals anti-CD31 en anti-PDGFR-β, In een overdekte 24-wells microtiterplaat.
  11. Was drie keer in PBS-Triton X (0,15%) over een totaal van 8 uur bij 4 ° C.
  12. Blok secties in 10% ezel serum in PBS-Triton X (0,15%) voor 30 minuten.
  13. Incubeer secties voor 8 uur 's nachts bij 4 ° C met passende secundaire antilichamen.
  14. Was drie keer in PBS-Triton X (0,15%) over een totaal van 8 uur bij 4 ° C.
  15. Re-fix samples in 4% PFA / PBS gedurende 30 minuten op ijs.
  16. Was drie keer in PBS-Triton X (0,15%) meer dan 30 minuten op ijs.
  17. Uitdrogen monsters door een gegradeerde MeOH / PBS-Triton X-serie: 25% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH, en 100% MeOH in 10 minuten voor elke stap. Vervang de 100% MeOH met verse MeOH na 10 minuten en incubeer 1 uur bij kamertemperatuur.
  18. In een glazen container, mix Babb (benzylalcohol: Benzyl Benzoate) in een 1:2 verhouding. Combineer Babb met MeOH voor een uiteindelijke concentratie van 50% Babb en 50% MeOH. Incubeer het monster in Babb: MeOH gedurende 10-15 minuten.
  19. Transfer monster tot een glazen fles met 100% Babb en incubeer gedurende 10-15 minuten of tot gewist, bij kamertemperatuur.
  20. Vul depressie dia (0,7 mm diepte) met verse 100% Babb en overdracht monster aan de zijkant. Voeg afdekglas (nr. 1.5) en de afdichting met 2-3 lagen van de nagellak. Laat nagellak uit te harden in het donker bij kamertemperatuur, vervolgens monster bewaren bij 4 ° C.
    Let op: Dia's moeten volledig worden voorafgaand aan de confocale beeldacquisitie verzegeld. Afbeeldingen moeten worden verworven binnen 12-24 uur, als fluorescerende kleurstoffen kunnen vervagen in Babb.
  21. Ga verder naar sectie 'Image Acquisition'.

5. Beeldacquisitie

  1. Image 10 urn bevroren secties met een confocale microscoop met behulp van de Plan-Apochromat 20X/0.8 doelstelling (512 x 512 pixels) met 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B 4), 543 - en 633-nm laser lijnen.
  2. Acquire confocale z-secties van ganse berg huid en 50 um agarose ingebedde coupes met behulp van de Plan-Apochromat 10X/0.4 doelstelling (512 x 512 pixels) met 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B 4), 543 -, en 633-nm laser lijnen. Serial Z-profielen moeten achtereenvolgens worden verzameld op 1-micron voor de respectievelijke kanaal.
  3. Reconstrueren serial Z-profielen met behulp van Zeiss AxioVision 4.6 of andere software voor beeldanalyse.

6. Representatieve resultaten:

Efficiëntie-etikettering van de embryonale vasculatuur is van cruciaal belang voor de beoordeling van bloedvaten defecten in de embryonale muizen. Figuur 1 toont de specifieke kenmerken van E16.5 thymus bloedvaten (1A-B) en co-labeling met CD31 (1B), in aanvulling op kleuring van de rechter en linker ventrikel (1E-F), respectievelijk. De GSL I-isolectin B 4 protocol voor vriescoupes, zoals beschreven in de secties 1, 3 en 5 werd gebruikt in deze experimenten. Whole-mount etikettering van de huid bloedvat netwerk op E16.5 muizen, met behulp van protocollen beschreven in de secties 1, 2 en 5 is weergegeven in figuur 1C-D.

figure-protocol-1
Figuur 1 Legend. FITC GSL I - isolectin B 4 gezichts-ader injecties in E16.5 muis embryo's. a. Cryosection van embryonale thymus na de injectie. b. samenvoegen van CD31 co-labeling met isolectin B 4. c. en d. Whole-mount van de embryonale bloedvaten de huid na de injectie. e. en f. Cryosection van de embryonale hart e. (rechts ventrikel) f. (linker ventrikel) na injectie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Whole-mount en PECAM-1 (CD31) kleuring op de afdelingen zijn de conventionele methoden voor etikettering van het vaatstelsel in de embryonale muizen. Deze methoden vereisen het gebruik van directe en / of indirecte immunofluorescentie, en reinigingsmiddelen om de muis weefsel permeabilize. Dit blijkt een nogal tijdig proces. Hier hebben we in dienst FITC-dextran of isolectin B 4 gezicht ader injecties om direct het etiket van de embryonale vaatstelsel, zodat er geen vereiste voor antilichaam labeling stappen....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidie ​​nummers R01AI055001 en R01AI082127 van NIAID naar NRM en SREB Proefschrift Fellowship Award aan JLB.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van het reagens Vennootschap Catalogus nummer
FITC-dextran Sigma FD150S-1G
Fluoresceïne gelabelde GSL 1 - isolectin B 4 Vector Laboratories FL-1201
Fast Green MP Biomedicals 195178
PFA Fluka 76240
Foetaal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550
Optimale Cutting Temperatuur Compound (OCT VWR 25608-930
Aceton JT Baker 9006-33
Donkey Serum Jackson 017-000-121
rat anti-muis CD31, BD Pharmingen 558736
geit anti-muis PDGFR-β R & D Systems AF1042
ezel anti-rat CD31 Alexa 647 (Invitrogen) Biolegend 102516
ezel anti-geit Alexa 594 (Invitrogen) Invitrogen A11058
Triton X -100 Sigma-Aldrich X-100
Low melt agarose / PBS Sigma-Aldrich A9414-25G
Methanol Fisher Scientific A413-4
Benzylalcohol Acros Wetenschappelijke 148390010
Benzylbenzoaat Acros Wetenschappelijke 105860010
Depressie dia's Fisher Scientific S175201
Fluorogel Electron Microscopy Sciences 17985-10
Dekglas (22x22) -1,5 Thermo Scientific 152222
Zeiss LSM 510 Meta confocale microscoop Zeiss
Micro ontleden tang Roboz RS-5135
Parafilm Nee OM992 Fisher Scientific 13-374-16
12 en 24 goed microplaten Evergreen Wetenschappelijke 222-8044-01F
Superfrost / Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
4 ml flacons duidelijk Nationale Wetenschappelijke B7800-2

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cuddihy, A. R. VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus. Blood. 113, 2723-2731 (2009).
  2. Muller, S. M. Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).
  3. Muller, S. M. Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus. J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).
  4. Foster, K. Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus. J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).
  5. Liu, C. Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization. Blood. 108, 2531-2539 (2006).
  6. Lavine, K. J. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
  7. Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice. J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).
  8. Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
  9. Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
  10. Murphy, P. A. Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Embryonale muisvasculatuurinjectie in de gelaatsFITC dextran labelenGSL 1 isolectine B4CD31 antilichaamkleuringPDGFR beta perivasculaircryosectieprotocolvibratoomsectieconfocale microscopie imagingthymus vasculair onderzoek

Gerelateerde artikelen