Kweken en Elektrofysiologie van cellen op NRCC Patch-clamp Chips

Samenvatting

We laten zien hoe vlakke patch-clamp chips gefabriceerd op de National Research Council of Canada worden gesteriliseerd, gegrond, geladen met medium, bedekt met cellen, en gebruikt voor elektrofysiologische opnamen.

Samenvatting

Door zijn uitstekende gevoeligheid en het vermogen om te bewaken en controleren van individuele cellen op het niveau van ionkanalen, patch-spannen is de gouden standaard van elektrofysiologie toegepast op de ziekte-modellen en farmaceutische schermen zowel ^1. De werkwijze omvat gewoonlijk zacht contact brengen van een cel met een glazen pipet opgevuld met een fysiologische oplossing om een stuk het membraan isoleren onder de top ^2. Een elektrode geplaatst in de pipet legt ionkanaal activiteit in het membraan pleister of wanneer gescheurd voor de gehele cel. In het laatste decennium patch-clamp chips zijn voorgesteld als alternatief ^{3, 4:} een onderbroken film scheidt de fysiologische medium uit het kweekmedium en een opening in de film microfabricated vervangt de top van de pipet. Patch-clamp chips zijn geïntegreerd in geautomatiseerde systemen en op de markt voor high-throughput screening ^5. Om incrgemakkelijk doorvoer zij omvatten de vloeibare levering van cellen van suspensie, de positie van het diafragma door afzuigen en geautomatiseerde routines cel-probe afdichtingen detecteren en sluiten gehele cel mode. We hebben gerapporteerd over de fabricage van een silicium patch-clamp chip met geoptimaliseerde impedantie en opening vorm die de hoge kwaliteit opname van actiepotentialen in gekweekte neuronen slak ⁶ toelaat, onlangs hebben we ook gemeld vooruitgang op weg naar het ondervragen van zoogdieren neuronen ^7. Onze patch-clamp chips worden vervaardigd op de Canadese Photonics Fabrication Center ^8, een commerciële gieterij, en zijn verkrijgbaar in grote series. We staan ​​te popelen om deel te nemen in samenwerking met elektrofysiologen het gebruik van de NRCC technologie in verschillende modellen te valideren. De chips worden gebruikt volgens de algemene regeling in figuur 1 weergegeven: de chip is aan de bodem van een plexiglas cultuur flacon en de achterzijde van de opening is verbonden met een ondergrondse-zendersel uitgerust met buizen aan weerszijden van het pakket. Cellen gekweekt in de flacon de cel van de sonde wordt bewaakt door een meetelectrode opgenomen in de twee buitenste channel.The vloeibare poorten oplossing, gemakkelijker met minimale verstoring van de cel is een voordeel ten opzichte van glas pipetten voor intracellulaire perfusie.

Figuur 1. Principe van de meting met behulp van de NRCC patch-clamp-chip

We detail hier de protocollen te steriliseren en ontluchten van de chips, ze laden met medium, plaat ze met cellen, en uiteindelijk deze te gebruiken voor elektrofysiologische opnamen.

Protocol

1. Chip fabricage

De werkwijze beschreven in ^{6 heeft} een 3 pm dikke zichzelf staande film laag 1 MOhm toegang weerstand en een glad oppervlak trechtervormige opening die een innig afdichting met de cel ⁹ vergemakkelijkt, zie figuur 2. De chips worden singulated en gelijmd in plexiglas pakketten met de opening geconfronteerd met een gat het aansluiten van de chip naar een ondergrondse kanaal. De lijmen wordt afgegeven zodanig dat de shunt capaciteit minimaliseert een nominale 17 pF. Pakketten worden uitgerust met twee diameter van 1,5 mm en 6 mm glazen buizen vloeibare poorten (figuur 3).

Figuur 2. Scanning electronen microscoop van een focused ion beam gedeelte van een NRCC patch-clamp chip toont een glad oppervlak en siliciumdioxide trechtervorm dat intieme cel contacten bevordert, en een ondiepe opening die goed is voor een lage instap resistance.

Figuur 3. Een chip gelijmd aan de onderzijde van de cultuur flacon in een plexiglas pakket voorzien ondergrondse vloeistofcomponenten en glazen buizen.

2. Sterilisatie, priming en testen

De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een biologie veiligheidskabinet om besmetting of het aansluiten van de opening te voorkomen.

• Steriliseren chips in een Harrick basis plasma reiniger (www.harrickplasma.com) met een 0.1-0.3 mbar resterende luchtdruk gedurende 15 min bij het maximale vermogen van 18 W. Andere luchtplasma kunnen worden gebruikt, met vergelijkbare vermogensdichtheid (24 mW / cm ³⁾ te regelen en het product van vermogen dichtheid en tijdconstante. De plasmabehandeling maakt ook de chips hydrofiele Dit vergemakkelijkt priming.
• Fit glazen buizen met een steriele Silastic Laboratorium silicone, 1mm ID x 2mm OD (Cole ParmerCat. # 96115-08), 3inch enerzijds 1 inch aan de andere zijde.
• Vul vloeistofcomponenten door de buizen met steriel gefilterd standaard fosfaatbufferoplossing (PBS), zorg ervoor dat er geen luchtbel is opgesloten.
• Knip de lange siliconenslang terwijl de druk in het PBS van de korte zijde op 1 atm. Een pool van PBS sijpelt door de opening kan zijn zichtbaar in de flacon. Klik de druk aanvoeren van de PBS en maak de korte siliconen tube van die levering.
• Vul flacon met gefilterd PBS behulp van een injectiespuit.
• Dompel een Ag / Ag: Cl-elektrode in de korte buis en een tegenelektrode in de flacon. Een impedantie meter wordt gebruikt om te bevestigen dat de toegang weerstand ligt tussen 300kohm en 3Mohm en de shunt capaciteit ligt tussen de 10pF en 25pF. Een chip met een lagere weerstand waarschijnlijk een lek, en een hogere capaciteit geldt als niet gebruikt aangezien het niet vangen de snelste dynamiek van elektrofysiologische de cel ^6. Een chip met een lagere capaciteitof hoger weerstand als aangesloten, terwijl het eenvoudig kan zijn dat een luchtbel opgesloten in de opening. Sommige chips worden opnieuw getest na 1H en voldoet aan de juiste elektrochemische impedantie hebben.
• Spoel de vloeibare kanaal met steriel gedeïoniseerd water, leeg de top flacon en spoel met hetzelfde, twee keer.
• Dompel de verpakte chip met buizen in zoet steriel gedeïoniseerd water voor 30min laad vervolgens met andere chips in een steriele container gevuld met steriel gedeïoniseerd water. Dit zorgt ervoor dat chips blijven hydrofiele en beschermd tegen vervuiling.

3. Chips voorbereiding in de celbiologie lab

De volgende stappen worden uitgevoerd in een HEPA-filter laminaire stroming kap met behulp van aseptische technieken, moeten alle oplossingen die gebruikt worden in deze procedure worden gefilterd gesteriliseerd met behulp van een 0.22μm filter.

• Open een chip bak onder een HEPA-gefilterde laminaire stroming kap en verwijder de chips van container naar beneden om te voorkomen dat scheppen mogelijk zwevende verontreinigingen in de top flacon.
• Spoel bovenkant van het flesje van de chip 2x met vers gefilterd steriel gedeïoniseerd water om eventuele resten van vuil te verwijderen van de chip oppervlak.
• Zuig steriel gedeïoniseerd water uit de top flacon.
• Sluit een uiteinde van de buis silastic aan de vloeibare kanaal een druk spuit met steriel gefiltreerd gedeïoniseerd water. In ons systeem, spuiten gevuld met oplossing zijn onder druk door aansluiting op een perslucht tank ingesteld op 20psi. Om de steriliteit te garanderen, wordt de lucht gefilterd (0,22 um filter) vóór binnenkomst in de spuit en ons systeem heeft ook een aan / uit klep die ons in staat stelt om te stoppen of druk uit te oefenen als dat nodig is.
• Met behulp van een hemostaat, klem de uitgang van de slang.
• Open de aan / uit kleppen aan de oplossing onder druk.
• Om de subterranen vloeibare van de chip afspoelen met steriel gedeïoniseerd water, vrij wilt de uitgang van de slang.
• Om voorce het water omhoog door de opening, klemt u de uitgang van de buis met een hemostat.
• Om de waterafvoer te vermijden, klem de input en output uiteinden van de buis met een hemostats en sluit de aan / uit kleppen.
• Maak de ingang uiteinde van de slang van de injectiespuit.
• Plaats glas worden aangesloten op beide uiteinden van de buizen en verwijder de hemostats.
• Vul top flacon met filter steriled gedeïoniseerd water.
• Plaats het deksel van een 35 mm steriele schaal in de basis van een 100 mm steriele gerecht
• Plaats chip op het deksel 35 mm en deksel met 100 mm schaal deksel.
• Afbeelding chips dat de membraan en opening van de chips zijn vrij van vuil en / of luchtbellen. In ons laboratorium wij een opstaande microscoop 20x lange werkafstand doel te gebruiken.
• Als er stof en / of luchtbellen aanwezig zijn, herhaaldelijk spoelen vloeibare kanaal en top flacon. Indien het puin en / of lucht kan worden verwijderd chip verwijderd.
• Zodra de chipsafgebeeld, terug te keren naar laminaire stroming kap en trek beide uiteinden van de buizen.
• Bevestig een uiteinde van de slang aan op een onder druk spuit met fysiologische media.
• Klem de uitgang van de buis met een hemostat
• Open drukventiel, verwijder de hemostaat van de uitgang einde van de vloeistofcomponenten en spoel de vloeibare kanaal met fysiologische media
• Om de ondergrondse vloeibare met fysiologische media spoelen, opent u de aan / uit kleppen en verwijder de hemostaat van de uitgang uiteinde van de slang.
• Om de fysiologische media opdrijven door de opening, klemt u de uitgang van de buis met een hemostat.
• Klem ingang uiteinde van de slang met een hemostat en sluit de aan / uit kleppen.
• Verwijder de ingang uiteinde van de slang uit de spuit en steek beide uiteinden van de buis met glas pluggen.
• Verwijder de hemostats.
• Verwijder het water van boven flacon.
• Vul de bovenste flacon met filter gesteriliseerd fysiologische media.
• Plaats de chip terug in de 100 mm petrischaal.
• Plaats de voet van een 35 mm schaal in de 100 mm schotel en vul deze met filter gesteriliseerd gedeïoniseerd water om de luchtvochtigheid te verrijken.
• Dek de schaal af tot het tijd is voor plating

4. Cel beplating van slak neuronen

De patch-clamp chips kunnen geschikt zijn voor verschillende preparaten. We zijn momenteel testen van onze chips met zoogdieren primaire corticale neuronen en hebben verkregen voorlopige resultaten met cellen gekweekt gedurende 14 dagen ^7, wat erop wijst dat onze sterilisatie-protocol adequaat is en dat de chips zijn niet cytotoxisch in lange termijn culturen. Voor de toepassing van dit protocol werden slak neuronen gekozen omdat ze een eenvoudige, maar goed gevestigde model voor neuronale elektrofysiologie ¹¹ te bestuderen, en het is met die cellen dat we de belangrijkste resultaten tot nu toe ¹⁰ verkregen. Gedetailleerde celisolatie en cultuur proceduresis eerder beschreven ^{12, 13.}

• Verwijder de buitenste schil van 2-3 maanden oud Lymnaea stagnalis met stompe pincet en Anesthetize dieren in Lymnaea zoutoplossing die 10% Listerine.

  Alle volgende stappen uitgevoerd aseptisch in een laminaire luchtstroom kap met gesteriliseerd dissectie apparatuur en oplossingen bij kamertemperatuur.

• Vervang de fysiologische media in de vloeistofcomponenten met de juiste opname oplossing met behulp van een Eppendorf pipet. Bij Lymnaea neuronen oplossing bevat (in mM) 50 KCl, 5 _MgCl2, 5 ethyleenbis (oxyethylenenitrilo) tetra-azijnzuur (EGTA) en 5 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES, pH 7,4 , 130 mOsm) ¹⁴
• Speld de slakken in een Sylgard schaal gevuld met Lymnaea zoutoplossing en verwijder hele brein, zoals eerder beschreven ¹³
• Behandel de isolated hersenen in bepaalde media (DM) met trypsine enzym (0,2%, Sigma, Catalog # T-9201) gedurende 18 minuten gevolgd door behandeling in DM en trypsine inhibitor (Sigma, soja, Catalog # T-9003) gedurende 15 minuten.
• Speld de hersenen in een kleine Sylgard schaal gevuld met een hoge osmolariteit gedefinieerde media (HODM - DM met glucose toegevoegd, 750 ul van 1 M glucose-oplossing om 20 mL DM).
• Met behulp van fijne pincet en dissectie schaar, verwijder de buitenste en binnenste omhulsel van de ganglia van belang, het blootstellen van de neuronen.
• Met behulp van een brand geslepen glazen pipet gevuld met HODM en bevestigd aan een injectiespuit zachtjes zuig de buurt van de cel van belang (linker pedaal dorsale 1) tot het neuron los van de hersenen en is geschorst in de pipet.
• De glazen pipet wordt dan verplaatst en gedompeld in individuele neurochips waar zachte verwijdering van het micro-kan de neuronen om voorzichtig naar buiten worden gedrukt de pipet en geplaatst op de top van de individuele patch gaten op de chips.
• Laat cellen ongestoord zitten minste 2 uur bij kamertemperatuur de bevestiging bevorderen de chip oppervlak rond de opening.

5. Elektrofysiologische registraties

De chips aansluiten aan de versterker (in ons geval een Multiclamp 700B versterker, Molecular Devices, Foster City, CA, USA)

• Plaats de oplossing in de vloeibare ondergrondse en de chip flacon met de juiste registratie oplossingen. Bij Lymnaea neuronen de bovenste cultuur kamers zijn gevuld met Lymnaea zoutoplossing (in mM: 51,3 NaCl, 1,7 KCl, 4 CaCl2 en 1.5 MgCl2) gebufferd tot pH 7,9 met HEPES ^14.
• Voor de stabiliteit, lijm de chip op een glasplaatje en het onder een microscoop te plaatsen.
• Om de chip te sluiten op de versterker (in ons geval een Multiclamp 700B versterker, Molecular Devices, Foster City, CA, USA), snij een uiteinde van de slang en plaats een Silver draad die is aangesloten op de hoofd-fase.
• Plaats de referentie-elektrode in de top flacon van de chip.
• De chip is nu klaar voor opname.
• Breng een 5 mV stap met de versterker om de totale weerstand te meten (R _t) en bepalen de configuratie van de neuronen: cel-ingeschreven (R _t> 1 GΩ); whole-cell (Rt = 50-100 MΩ plus capacitieve transiënten, indicatieve van membraan scheuren over het diafragma), of geen zegel (R _t <5 MΩ). In onze laatste set van experimenten ^10, 58% procent van de cellen met hoge weerstand afdichtingen had, en van die 80% van de cellen toonde opgewonden reacties.

6. Representatieve resultaten

• Breng depolariserende stroompulsen (20 pA increment) het neuron (in dit geval LPeD1).
• Houd het neuron bij Vm dicht bij haar rustpotentiaal (~ - 60 mV).
• Houd u aan de antwoorden op deze depolariserende pulsen. Overschrijding actiepotentialen moetworden waargenomen als het neuron levensvatbaar is.
• Figuur 4 toont een representatief resultaat dat in detail besproken in ^{14, 15.}

Figuur 4. Spanning reacties (top) een LPeD1 neuron aan graded reeks intracellulaire stroompulsen (onder). De stroompulsen werden op Vm = - 60mV.

Problemen oplossen

• Voordat plating, het beeld chips te bepalen of membraan en diafragma zijn vrij van vuil en geschikt voor plating. We maken gebruik van een rechte microscoop en een 20x lange werkafstand doelstelling. In onze laatste set van experimenten ^1, werden 67% procent van de chips met succes voorbereid op die manier.
• Als er stof en / of luchtbellen aanwezig zijn gooi-chip en probeer een andere.
• Diverse oppervlaktebehandelingen (plasma) of coatings (PDL, PEI, etc.) kunnen worden geprobeerd, maar het succes kan zijn sterk afhankelijk van celtypegebruikt.
• De samenstelling van de vloeibare ("pipet") oplossing in kritieke voor de vorming van de giga-afdichting en de hele cellen. Pas oplossing, met aandacht voor osmolariteit, pH en ionische make-up.
• Voor de langere termijn cultuur, te beginnen met de media in microfluïdische kanaal, schakel dan vóór pipetteer oplossing om de opname via de zachte zwaartekracht gevoede perfusie (~ 0,5 ml / min).

Discussie

NRCC's patch-clamp chip ondervraging platform is een potentieel krachtig hulpmiddel voor hoge informatie-inhoud farmaceutische testen en te onderzoeken in vitro modellen van de ziekte. De voordelen ten opzichte van glas pipetten een laag toegang weerstand, die een voordeel grote cellen probe, en ondanks een iets grotere capaciteit resulteert in dynamiek vergelijkbare kleinere cellen. Spontane cel om diafragma zegels zijn routinematig verkregen, en hele celinvoer is waargenomen dat spontane ¹⁴ te zijn. Een duidelijk verschil tussen chips en het glas pipet methode is dat de probe deel van de cel kweekschaal en niet handmatig in contact gebracht met de celmembraan. Het kweken van cellen, eventueel van functionele netwerken, resulteert in biologisch relevante modellen ziektemodellen en een ander mechanisme voor het vastzetten hoge cel sonde afdichtingen ^16. Echter, in tegenstelling tot celsuspensies, aspiratie cannot worden gebruikt om een ​​cel op de sonde positioneren. Slak neuronen, zoals andere grote cellen, vatbaar zijn voor manuele positionering van de sonde. Voor kleinere cellen die een langere tijd cultuur hebben wij overbodig maakte een manipulatie en houdt een grote kans op het verkrijgen van een afdichting met patronen hechting Polypeptiden bovenop de probes cellen bovenop de probes en aangetoond plaatsing van cellen op de probe ^17,18.

NRCC wordt ook aan een polyimide microfluïdisch patch-clamp chip ¹⁹ met een capaciteit vergelijkbaar met die van glas pipet. Het uiteindelijke doel van dat project is een multiple-probes patch-clamp-chip die het mogelijk maakt de gelijktijdige controle van de elektrofysiologische activiteit van een aantal neuronen betrokken zijn in het netwerk van gedrag bij de resolutie van de individuele ionkanalen ^14. Deze methode is een hoge resolutie complementaire methode multi-elektrode arrays 20.