Method Article

Evaluatie van kankerstamcel Migratie Met behulp van compartimentering microfluïdische apparaten en live cell imaging

DOI:

10.3791/3297

⸱

December 23rd, 2011

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 2Materials Science Program, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin-Madison, 4Carbone Comprehensive Cancer Center and Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Wisconsin-Madison

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een compartimentering microfluïdische apparaat voor het onderzoeken van kanker stamcellen migratie wordt beschreven. Deze roman platform creëert een levensvatbare cellulaire micro-omgeving en maakt microscopische visualisatie van levende cellen voortbewegen. Zeer beweeglijke kankercellen worden geïsoleerd om moleculaire mechanismen van agressieve infiltratie, wat kan leiden tot een meer doeltreffende toekomstige therapieën te bestuderen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de laatste 40 jaar, de Verenigde Staten meer dan 200 miljard dollar geïnvesteerd in onderzoek naar kanker, wat resulteert in slechts een daling van 5% in sterfte. Een belangrijk obstakel voor het verbeteren van patiëntresultaten is het slecht begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan cellulaire migratie geassocieerd met agressieve kankercel invasie, metastasering en therapeutische resistentie 1. Glioblastoma multiforme (GBM), de meest voorkomende primaire kwaadaardige volwassen hersentumor 2, is een voorbeeld van dit probleem. Ondanks standaard chirurgie, bestraling en chemotherapie, patiënten mediane overleving is slechts vijftien maanden, als gevolg van agressieve GBM infiltratie in aangrenzende hersenen en snelle kanker terugkeert 2. De interacties van afwijkende cellen trekkende mechanismen en de tumor micro-omgeving waarschijnlijk onderscheiden kankercellen van normale cellen 3. Het verbeteren van therapeutische benaderingen voor GBM vereist een beter begrip van kanker celmigratie mechanismen. Recent onderzoek wijst erop thata kleine subpopulatie van cellen in GBM kan de hersentumor stamcellen (BTSC), verantwoordelijk voor therapeutische weerstand en herhaling. Onderliggende mechanismen van BTSC trekkende capaciteit nu pas een begin worden gekenmerkt 1,4.

Door een beperking in visueel onderzoek en geometrische manipulatie conventionele migratie assays 5 beperkt tot kwantificeren totale celpopulaties. In tegenstelling, microfluïdische apparaten toestaan ​​single cell analyse vanwege compatibiliteit met moderne microscopie en controle over de micro-omgeving 6-9.

We presenteren een methode voor gedetailleerde karakterisering van BTSC migratie met behulp van compartimentering microfluïdische apparaten. Deze PDMS-en-klare apparaten wierp de weefselkweek omgeving in drie verbonden compartimenten: zaaien kamer, ontvangst kamer en het overbruggen van microkanalen. We toegesneden het apparaat zodanig dat beide kamers voldoende media houden om levensvatbare BTSC ondersteuning voor 4-5 days zonder media-uitwisseling. Zeer mobiele BTSCs eerste instantie in de seeding kamer worden geïsoleerd na de migratie wel overbruggen microkanalen op de parallelle opvangkamer. Deze migratie simuleert kanker cellen verspreid door de interstitiële ruimten van de hersenen. De fase live beelden van celmorfologie tijdens de migratie worden opgenomen over meerdere dagen. Over grote afstanden trekkende BTSC kan dus geïsoleerd, recultured, en geanalyseerd verder.

Compartimentering microfluidics kan een veelzijdig platform om het trekgedrag van BTSCs en andere kanker stamcellen te bestuderen. Door het combineren gradiënt generatoren, vloeistofverwerking, micro-elektroden en andere microfluïdische modules kunnen deze inrichtingen ook worden gebruikt voor het screenen van geneesmiddelen en diagnose van de ziekte 6. Isolatie van een agressieve subpopulatie van migrerende cellen van studies van de onderliggende moleculaire mechanismen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. BTSC's cel dissociatie

BTSCs zijn afgeleid van bestaande culturen gekweekt in serumvrij medium stamcel als neurosferen. cultuur waarvan eerder beschreven 10, 11.

  1. Bereid celsuspensie van BTSC afgeleide neurosferen. BTSC afgeleide neurosferen worden verzameld in een 15 ml conische buis en gecentrifugeerd bij 900 rpm gedurende 5 minuten. Snellere centrifugeren kunt scheren, en / of schade aan het neurosferen. Supernatant wordt afgezogen en neurosfeer cultuur wordt opnieuw gesuspendeerd in 0,5 ml voorverwarmde Accutase. Deze oplossing wordt gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C waardoor de neurosferen los te maken. Cellen worden mechanisch afgebroken met 10-20 zachte bewegingen van een P100 pipet en vervolgens 1,5 ml van stamcellen medium wordt toegevoegd aan de cellen aan de Accutase neutraliseren.
  2. De BTSCs gecentrifugeerd bij 1300 rpm gedurende 5 minuten en opnieuw gesuspendeerd in 1 ml van stamcellen medium.
  3. Een 50 pi aliquot wordt verwijderd uit de Suspension en in een microcentrifuge buis celtelling. 50 ul van trypan blue wordt toegevoegd aan de Eppendorf buis en de suspensie wordt in een hemocytometer voor celtelling.
  4. Eventueel na celtellingen, wordt extra stamcel medium toegevoegd aan de BTSC suspensie tot een celdichtheid van 20.000 levende cellen / ul media geven.

2. Fabricage van bi-gelaagde su-8 meester en gieten van PDMS stempel (zie figuur 1)

We maken gebruik van optische lithografie en zachte lithografie om su-8 meester en PDMS stempel, die essentieel zijn voor de montage van de microfluïdische apparaten te fabriceren. Iets anders dan de standaard procedure 12, wordt onze su-8 meester bestaat uit twee lagen. De 3-urn hoge microkanalen zijn gegoten in de eerste / onderste laag eerder in het proces, terwijl de 250 urn hoge zaaien en die kamers in de tweede / bovenlaag. Met het oog op een juiste aansluiting tussen twee cultuur compartimenten (microkanaals en kamers), de twee lagen moeten nauwkeurig worden uitgelijnd in positie. Echter, de dikte en dichtheid van de tweede laag groot genoeg zijn om het referentiemerkteken / optische aligner blokkeren toegang tot de bodemkenmerken. Hier hebben we het ontwerp van de maskers met de vaste markers worden op afstand geplaatst. Aldus kunnen deze merkers in de eerste laag selectief worden afgeschermd tijdens het draaien van de tweede laag. Daardoor zijn beide lagen functies die in een master en klaar voor het vormen in reliëf van de PDMS stempel.

  1. Ontwerp en bereidt u twee foto-maskers. Een masker bestaat uit twee referentiepunten markers en een array van microkanalen (400 um lang en 10-50 urn breed) voor de eerste laag. Ander masker bestaat uit zaaien en ontvangen kamers (2 mm lang en 600 um breed) voor de tweede laag. Beide maskers zijn ontworpen in Illustrator (Adobe, California), laser-geprint op transparante films (Thin metalen onderdelen, Colorado), gereinigd met isopropanol en lucht gedroogd.
  2. Maak de eerste laag metsu-8 fotolak (Microchem, Massachusetts) volgens de handleiding van het product van leverancier. Eerste spin-coat de handgreep wafer (WRS Materials, California) met 3-urn dikke fotoresist van su-8 (5), gevolgd door zacht bakken. De fotolak wordt dan blootgesteld ultraviolet en uitgehard met de bijbehorende masker in close-contact, gevolgd door post-bakken en ontwikkelen.
  3. Spin-coat de tweede laag met 250 pm dikke su-8 (2100). Om dikke fotoresist verstopt raakt het referentiemerkteken markers van de eerste laag behandelen we deze gebieden met plakband in voor spin-coating van de tweede laag. De band wordt dan afgepeld de markers openbaren uitlijning doel.
  4. UV-bloot de tweede laag met de tweede masker. Met de uitlijningstekens geopenbaard, is het eenvoudig om ze af te stemmen op die in de tweede masker met behulp van optische masker aligner. De tweede laag fotolak wordt dan ultraviolet belicht en uitgehard in close-contact, gevolgd door post-bakken en ontwikkelen.
  5. Anti-stick de vacht van de geresulteerd meester. Om te helpen bij het verwijderen van uitgeharde PDMS, kan de su-8 meester worden gesilaniseerd via damp depositie op het oppervlak een anti-aanbak-type coating. Plaatst deze in een exsiccator gedurende ten minste een uur, met enkele druppels trichloor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silaan oplossing onder vacuum.
  6. Mold PDMS met de master. Meng prepolymeer basis en genezer van PDMS Sylgard 184 (Dow Corning, Michigan) in verhouding 10:1 grondig. Plaats het in een exsiccator voor vacuüm ontgassen tot er geen luchtbel wordt gezien. Opnieuw giet het mengsel op het masker en ontgas als nieuwe luchtbel geïntroduceerd. Hard de schimmel op een niveau kookplaat 2 uur bij 90 C. Na afkoeling tot kamertemperatuur voorzichtig laat de PDMS stempel. Aldus worden kanalen kweken gegraveerd in PDMS en klaar voor montage van de inrichting. De master is herbruikbaar voor het vormen totdat deze is gebarsten of versleten. De anti-aanbaklaag opnieuw moet worden uitgevoerd wanneer de kleverigheid herwint.

3.Montage van microfluïdische apparaten en celcultuur (figuur 2)

Met het oog op de cultuur-cellen, is voorzien van gegraveerde PDMS stempel bevestigd aan een glazen dekglaasje op ingesloten kanalen te vormen. En uitlaten zijn gemaakt voor het laden van de cultuur / media. Ondertussen cleanup en andere procedures om het glassubstraat en PDMS stempel zijn nodig om de cel-compatibiliteit.

  1. Maak reservoirs door de PDMS stempel met behulp van een biopsie perforator. We kiezen hun diameter tot 6 mm. Deze reservoirs dienen voor twee doeleinden. Men te houden extra voedingsstof voor celgroei. De andere is voor de toegang van pipet laden en vacuüm aspiratie.
  2. Week de PDMS stempel in 70% ethanol gedurende 30 min en vervolgens te spoelen met gedeïoniseerd water nog 10 minuten. Het doel is om duidelijk mogelijke organische reststromen die tijdens fabricage proces, en niet-verknoopte PDMS besmetting. Meer intense en grondige reiniging processen zoals biologische extractie 13 En Soxhlet extractie 14 werden elders gebruikt. Maar we vonden het niet nodig in BTSC cultuur.
  3. Steriliseer de PDMS stempel met autoclaaf (121 ° C, 35 min). Deze stap voltooit de verdere verknoping reactie van PDMS. Uitgaande van deze stap en tot stap 3.6, alle procedures zijn genomen in een steriele manier.
  4. De PDMS stempel wordt dan gelegd op een glazen dekglaasje die tevoren is bekleed met poly-L-lysine. 15-17 De inrichting wordt dan bedekt met laminine door het invullen van het kanaal met laminine oplossing overnacht bij 37 ° C. Laminine wordt aangezogen uit de inrichting en de inrichting wordt gewassen met stamcellen medium.
  5. Laad celsuspensie van stap 1 in reservoirs en kanalen. 11 pl van gedissocieerde cellen zijn geplaatst in een reservoir zaaien. Vacuüm aspiratie wordt gebruikt om cellen te ver in de kamer zaaien, indien nodig. Eens 7 pl cellen worden de aangrenzende seeding reservoir. Opmerking: De gemiddelde celdichtheid van 20.000 cellen / ul media. Achteruiter vijf minuten, het zaaien en het ontvangen van reservoirs worden overspoeld met media.
  6. Plaats een 0,5-1 mm pre-geautoclaveerd PDMS vel bovenop. De natuurlijk opgetreden oppervlaktehechting tussen twee PDMS stukken zal de celcultuur afgesloten en klaar voor transport, incubatie en microscopische beeldvorming.

4. Lange termijn time-lapse imaging van BTSC migratie met BioStation IM (Nikon Instruments Inc, Melville, VS).

De combinatie van camera, software en incubator in een doos, dit microscopische systeem maakt het mogelijk om beeld celcultuur zonder verstoring voor dagen. Daarnaast zijn unieke motor ontwerp beweegt het objectief en houdt monstertafel stationair op point-bezoek-functie. Dit maakt het praktisch is om beeld parallelle experimenten en spoor cel locomotie van high-throughput assay.

  1. Pre-equilibreren de Biostation IM gedurende 45 minuten om de temperatuur, vocht en lucht te stabiliseren. Toevoeging van een aantal water-contained schotels in monsterkamer wordt gebruikt om de juiste vochtigheid te handhaven.
  2. Laad de cel-inrichting die in de monsterkamer van de microscoop, en centreer deze met behulp van micro pincet.
  3. Stel de scherpstelling, stand-punten en tijdstippen in Biostation software en start de time-lapse.

5. Representatieve resultaten:

Voorbeelden van visuele inspectie en karakterisatie van Kankercel Migratie door een compartimentering microfluïdische apparaat zijn in figuur 3 en figuur 4. De cel-lijn is BTSC. Met de huidige opstelling kunnen fasebeelden van celkweek continu opgenomen zolang 5 dagen (figuur 3) en zo vaak als elke 2 seconden (Figuur 4). Meer dan 5 dagen, cultuur media moeten worden vervangen voor aanvullen van en afval verwijderd. Onze lange termijn time-lapse identificeert een draaiende reeks van zes cel stadia tijdens de migratie op basis van de morfologische veranderingen. Zoals afgebeeldgeconcentreerd in figuur 3, beschrijven we ze als (i) pre-migratie, (ii) inleiding, (iii) pad-exploratie, (iv) cruisen, (v) bestemming-exloration en (vi) na de migratie. In de opvangkamer, spoelvormige cellen verblijven in stap (i) als in bulk tumoren die kunnen groeien, delen en geleidelijk over. Bij het naderen van de microkanaal ingang, een paar cellen overgaan tot fase (ii) wanneer zij uit te breiden en het genereren van lijm uitsteeksel. Slechts een van hen kan de ingang bezetten en trap (iii) dat de migratie richting kan verkennen doorgaan. Zodra de cel bepaalt de migratie richting, bespreekt dit stadium (iv) om mee te varen door de microkanaal in een gestage en hoge snelheid, die wordt gedragen door de hele microkanaal. Eind microkanaal, cel verder naar stap (v) om de open ruimte van opneemkamer verkennen en naar trap (vi). In microkanaal, migreert vermogen veelal afkomstig blaarachtig activiteit zoals geïllustreerd in figuur 4, vergelijkbaar met die van amoeboïde cell. Cel blaarachtig en membraan vervorming zijn volledig hier opgenomen.

figure-protocol-1
Figuur 1. Schema's van de fabricage van microfluïdische apparaat. Het hele proces wordt uitgevoerd op een 3-inch silicium wafer handvat door middel van een aangepaste techniek van zachte lithografie. 3 urn hoge microkanalen en uitlijningstekens worden gemaakt in de eerste laag. Dan 250 urn dikke su-8 spin-coating, terwijl de centreermarkeringen zijn bedekt met plakband, zodat zij later kunnen toegankelijk zijn aligner maskeren zonder zicht-blokkerende door dikke fotoresistlaag. Aldus kan kamer eigenschappen worden als de tweede laag en nauwkeurig uitgelijnd op de eerste laag. PDMS stempel wordt uiteindelijk gevormd uit de resulterende master.

figure-protocol-2
Figuur 2. Schema van het apparaat assemblage en cel zaaien proces. Ingesloten door PDMS en glkont dekglaasje, wordt de 3D kweken ruimte bestaat uit kamers, reservoirs en microkanalen. Het zaaien wordt gevuld met celkweek, terwijl de opvangkamer wordt aanvankelijk gevuld met celvrije media. De microkanalen die verbinding tussen hen cel migratie pad van zaaien links naar ontvangende kant.

figure-protocol-3
Figuur 3. BTSC migratie door microkanaal. Boven: snapshots van time-lapse tonen een enkele cel (groen gemarkeerd) migreert meer dan 400 micrometer uit de seeding kant aan de ontvangende kant. De hele reis duurt ongeveer 2 dagen, waarbij een reeks van cel morfologische veranderingen. De schaalstaaf is 40 pm. Onder: een cartoon vertegenwoordiging van zes migratie fasen. Pre-migratie (i) het zaaien kamer spoelvormige en deelbaar cellen geleidelijk migreren langs elkaar. De cellen in de buurt microkanaal ingang race met elkaar door polariserende cellichaam en e xerting lamellipodia uitsteeksel. Initiatie (ii): De trekkende cel met de hoogste capaciteit neemt het kanaal ingang, terwijl haar concurrenten terugtrekken zal. Path-exploratie (iii): De trek cel verandert in een amoeboïde mode met weinig polariteit. Deze migratie-modus is uiterst beweeglijk en in staat om weg te verkennen in alle richtingen door blaarachtig kleine membraan uitsteeksels. Cruising (iv): Zodra de migratie pad wordt bepaald, de cel verandert in een aangepast amoeboïde modus door het behoud van een extra groot uitsteeksel rubriek naar voren. Zo cel handhaaft een hoge motiliteit en een constante richting en snelheid. Bestemmings-exploratie (v): Bij path-end, de cel vertraagt ​​en ontwikkelt filopodias te verkennen de opvangkamer voor invasie doel. Post-migratie (vi): Na het invoeren van de ontvangende kamer, cel verandert in stervormige en behoudt een hoge beweeglijkheid, maar geen bepaalde richting.

"/>
. Figuur 4 Snapshots van time-lapse tonen de cyclus van blaarachtig activiteit en membraan vervorming van een BTSC: (AB). initiatie; (BD). Uitbreiding; (DF). Terugtrekken. De pijlen en curve-lijn geven de richting en de plaats van membraan vervorming respectievelijk. De snapshots worden verzameld om de 8 seconden.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De microfluïdische apparaat en beeld-opnametechniek hier gepresenteerde maakt een visuele karakterisering van cellulaire morfologie tijdens de migratie. In vergelijking met bestaande conventionele methoden, de microfluïdische platform biedt voordelen van kosteneffectiviteit, high throughput en design flexibiliteit. De gepresenteerde microscopische visualisatie systeem maakt studie en opnemen van langdurige levende celmigratie. De lens-gemotoriseerde functie maakt het mogelijk om meerdere migratie paden te volgen in een hoge beeld-resolutie zonder verstoring van het monster.

Tijdens assemblage van de inrichting, de PDMS stempel niet vast op de glazen dekglaasje voor het gemak van PDL coating (stap 3.4). Is het essentieel om een ​​goede afdichting voor het succes van dit protocol bereiken. Verontreiniging die vanaf het apparaat fabricage, zoals luchtbel in de stempel of stof / vuil op het substraat kan brengen de hechting en resulteren in het weglekken van vocht. Daarom TREATIng van het apparaat in een stofvrije manier is belangrijk om te voorkomen dat apparaat defect. Voorafgaand aan de PDL-coating, de dekglaasjes zijn salpeterzuur behandeld en de oplossing wordt gecentrifugeerd PDL stof / vuil te verwijderen. We vinden Scotch tape, alcohol spoelen, en waterbad zeer behulpzaam bij het verwijderen van stof / puin van de PDMS stempel, als een schone kamer is niet toegankelijk. Na de PDMS stempel maken van contact met het glas dekglaasje, het aanboren van de stempel voorzichtig met een pincet vergemakkelijkt de afdichting.

BTSCs kan worden verrijkt door menselijke operatiekamer exemplaren via bol cultuur in stamcel medium, vergelijkbaar met de cultuur van de normale neurale stamcellen 10. BTSCs verrijkt op deze manier tonen stamcelachtige eigenschappen, zoals expressie van markers stamcellen (CD133, nestin), differentiatie meerdere neurale lineages (gliale en neuronale) en tumorinitiatie in een orthotope immunodeficiënte muismodel met zo weinig als 100 cellen 18. Hoewel enige discussie bestaat over zuiveringcatie en het onderhoud van BTSCs 1, 19-21, bol-grown BTSCs beter behouden het fenotype en genotype van de ouders tumor 22-24.

De gecompartimenteerde ruimte bootst de fysiologische omgeving voor cel migratie. In ons apparaat, BTSC vertonen een sterke capaciteit van migratie door middel van een op grootte beperkte ruimte door het reguleren van cellulaire morfologie. Onze karakterisering van de cel morfologische veranderingen geeft mode-transformaties in een zestal theaterproducties sequentie die een mogelijke nieuwe gedetailleerde beschrijving van BTSC invasie van aangrenzende hersenen kan modelleren. In vroege stadia de cellen een aanmerkelijk hoeveelheid polariteit en genereren kleefstof effectief uitsteeksels zich verankeren in het microkanaal. Zodra de cel bezetting in de microkanaal is gevestigd, het converteert naar een cruise-modus en onderhoudt deze modus voor de volledige reis door een microkanaal. In dit stadium, BTSC behoud van een hoge beweeglijkheid en consistente richting, maar energie te besparen. Interestingly blijkt dat een microkanaal beperkt tot een cruising cel tegelijk, zodanig dat wanneer een cel door naar dit stadium andere cellen terugtrekken uit het microkanaal. Dit mechanisme zorgt ervoor dat de verwachte doeltreffendheid van de tumor te verspreiden en voorkomt overconsumptie van voedingsstoffen in microkanaal. Na het voltooien van de migratie over de microkanaal, een cel herwint haar neiging tot multidirectionele uitsteeksels en verdere exploratie invasie doelen of nieuwe migratie paden. De compartimentering microfluïdische apparaat biedt een nieuwe in vitro betekent het creëren van een micro-omgeving voor het bestuderen van BTSC infiltratie van de hersenen parenchym.

Deze werkwijze kan gemakkelijk worden aangepast aan de studie van kanker stamcellen (CSC) en trekkende cellijnen afgeleid van andere soorten tumoren. Kweken van cellen in de microfluïdische inrichting kan uitgevoerd worden in elke moderne biologie laboratorium dat is uitgerust met een incubator en weefselkweek expertise. Uitgerust met een su-8 meester, PDMSgieten en het apparaat assemblage haalbaar zijn met een aantal fundamentele opleiding in zachte lithografie. Daarnaast kan het platform worden uitgebreid voor andere toepassingen met integratie van andere functionele modules zoals gradiënt mixer, oppervlakte patronen, vloeibare controle en microelectrode.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PAC wordt gedeeltelijk ondersteund door een NIH T32 subsidie ​​bij Universiteit van Wisconsin Stem Cell Training Program (PA Clark). JSK werd gedeeltelijk ondersteund door de HEADRUSH Hersentumor Onderzoek hoogleraar, Roger Loff Memorial GBM Onderzoek Fonds, en de UW Foundation / Neurochirurgie hersentumor onderzoek en onderwijs Fonds. JCW en YH worden gedeeltelijk ondersteund door NIH subsidie ​​NIBIB 1R01EB009103-01.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Naam van het reagens Vennootschap Catalogusnummer Reacties
Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM), hoge glucose Gibco / Invitrogen 11965 Hersentumor stamcellen (BTSC) cultuur benodigdheden
Ham's F12 Gibco / Invitrogen 31765 Hersentumor stamcellen (BTSC) cultuur benodigdheden
B27 supplement minus vitamine A Gibco / Invitrogen 12587-010 Hersentumor stamcellen (BTSC) cultuur benodigdheden
Antibiotica-Antimycoticum (PSA) Gibco / Invitrogen 15240 Hersentumor stamcellen (BTSC) cultuur benodigdheden
Epidermale groeifactor (EGF), humane recombinant Gibco / Invitrogen PHG0313 Hersentumor stamcellen (BTSC) cultuur benodigdheden
basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), humaan recombinant Gibco / Invitrogen PHG0021 Hersentumor stamcellen (BTSC) cultuur benodigdheden
Heparine natriumzout van varkens intestinale mucosa Sigma H1027-250KU Hersentumor stamcellen (BTSC) cultuur benodigdheden
Laminine (natuurlijke muis) Gibco / Invitrogen 23017-015 Hersentumor stamcellen (BTSC) cultuur benodigdheden
Accutase Millipore SCR005 Hersentumor stamcellen (BTSC) cultuur benodigdheden
Stamcel medium
  • 30% Hams F12
  • 70% DMEM
  • 1% antibioticum-antimycoticum
  • 2% B27 zonder vitamine A
  • EGF (20 ng / ml) en bFGF / heparine (20 ng/ ML bFGF, 5 mg / ml heparine) Meng ingrediënten steriel filter voor gebruik
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) / heparine
  • Aliquot concentratie 20 pg / ml
  • Voor 25 ug: Voeg 1,25 ml heparine 5mg/ml tot 25 pg bFGF.
  • Voor 250 ug: Voeg 1 mL 5mg/ml Heparin tot 250 pg bFGF. Overbrengen naar 15 ml conische en voeg 11,5 ml 5 mg / ml heparine conische.
  • Store als 50 ul of 250 ul aliquots bij -80 ° C.
Epidermale groeifactor (EGF)
  • Aliquot concentratie 20 pg / ml
  • Voor 200 ug: Voeg 1 mL steriel DMEM (Gibco 11965-118) tot 200 ug EGF. Overbrengen naar 15 ml conische en voeg 9 ml DMEM.
  • Voor 500 mg: Voeg 1 mL steriel DMEM (Gibco 11965-118) tot 200 ug EGF. Overbrengen naar 50 ml conische en voeg 24 ml DMEM.
  • Bewaar als 50 & mu, L of 250 ul aliquots bij -80 ° C.
Heparine
  • Aliquot concentratie 5 mg / ml
  • Weeg 100 mg heparine.
  • Voeg 100 mg heparine bij 20 ml (70%) DMEM-(30%) F12-(1%) PSA (14 ml DMEM, F12 6 ml, 200 pi PSA)
  • Steriel filter
  • Store als 50 ul of 250 ul aliquots bij -80 ° C
su-8 fotolak Microchem
Silicon handgreep wafer WRS Materialen 3P01-5SSP-INV
trichloor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silaan Sigma-Aldrich 448931
PDMS Sylgard 184 Dow Corning
laminine BD Bioscience 50 ug /ml in PBS buffer voor de eindconcentratie
Biostation IM Nikon instrumenten

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carke, M. F. Cancer Stem Cells-Perspectives on Current Status and Future Directions. AACR Workshop on Cancer Stem Cells. Cancer Research. 66, 9339-9344 (2006).
  2. Stupp, R. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352, 987-996 (2005).
  3. Sahai, E. Mechanisms of cancer cell invasion. Current Opinion in Genetics & Development. 15, 87-96 (2005).
  4. Shackleton, M., Quintana, E., Fearon, E. R., Morrison, S. J. Heterogeneity in Cancer: Cancer Stem Cells versus Clonal Evolution. Cell. 138, 822-829 (2009).
  5. Karnoub, A. E. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449, 557-557 (2007).
  6. Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based Devices: New Tools for Studying Cancer and Cancer Stem Cell Migration. Biomicrofluidics. 5, (2011).
  7. Rolli, C. G., Seufferlein, T., Kemkemer, R., Spatz, J. P. Impact of Tumor Cell Cytoskeleton Organization on Invasiveness and Migration: A Microchannel-Based Approach. Plos One. 5, (2010).
  8. Chung, S. Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform. Lab on a Chip. 9, 269-275 (2009).
  9. Irimia, D., Toner, M. Spontaneous migration of cancer cells under conditions of mechanical confinement. Integrative Biology. 1, 506-512 (2009).
  10. Svendsen, C. N. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 85, 141-152 (1998).
  11. Clark, P. A. Glioblastoma cancer stem cells exhibit decreased dependence on exogenous growth factors for proliferation and survival. , Forthcoming Forthcoming.
  12. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie-International Edition. 37, 551-575 (1998).
  13. Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab on a Chip. 7, 987-994 (2007).
  14. Regehr, K. J. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab on a Chip. 9, 2132-2139 (2009).
  15. Dent, E. W. Filopodia are required for cortical neurite initiation. Nature Cell Biology. 9, 1347-1347 (2007).
  16. Hu, X. D., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. Activity-Dependent Dynamic Microtubule Invasion of Dendritic Spines. Journal of Neuroscience. 28, 13094-13105 (2008).
  17. Vitzthum, L. Study of Na(+)/H(+) exchange-mediated pH(i) regulations in neuronal soma and neurites in compartmentalized microfluidic devices. Integrative Biology. 2, 58-64 (2010).
  18. Clark, P. A., Treisman, D. M., Ebben, J., Kuo, J. S. Developmental signaling pathways in brain tumor-derived stem-like cells. Developmental Dynamics. 236, 3297-3308 (2007).
  19. Chen, R. H. A Hierarchy of Self-Renewing Tumor-Initiating Cell Types in Glioblastoma. Cancer Cell. 17, 362-375 (2010).
  20. Pollard, S. M. Glioma Stem Cell Lines Expanded in Adherent Culture Have Tumor-Specific Phenotypes and Are Suitable for Chemical and Genetic Screens. Cell Stem Cell. 4, 568-580 (2009).
  21. Lobo, N. A., Shimono, Y., Qian, D., Clarke, M. F. The biology of cancer stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 675-699 (2007).
  22. Singh, S. K. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
  23. Lee, J. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).
  24. Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Research. 64, 7011-7021 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cancer Stem Cell MigrationCompartmentalizing Microfluidic DevicesLive Cell ImagingBrain Tumor Stem CellsMicrochannel Migration AnalysisPDMS Device FabricationTime Lapse MicroscopyCell Dissociation ProtocolSingle Cell AnalysisMigratory Cell Isolation

Related Articles