Analyse van Trunk neurale cel migratie met behulp van een gewijzigd Zigmond Kamer Assay

Summary

Een benadering om de migratie van cellen geëxplanteerde (trunk neurale cellen) analyseren beschreven. Deze methode is goedkoop, zacht en kunnen onderscheiden chemotaxis van zowel chemokinesis en andere invloeden op trekkende polariteit zoals die afgeleid van cel-cel interacties in de primaire neurale stam celkweek.

Abstract

Neurale cellen (NCC) een voorbijgaande populatie van cellen in de ontwikkeling van vertebraten die uit de dorsale neurale buis (NT) NZ na het ondergaan van een epitheliale-mesenchymale transitie ^1,2. Na EMT, NCC's migreren grote afstanden langs stereotype paden totdat ze hun doelstellingen. NCC's differentiëren tot een breed scala aan celtypes waaronder neuronen, glia, melanocyten, en chromaffin cellen ^1-3. Het vermogen van NCC's te bereiken en herkennen hun juiste doellocaties is fundamenteel voor de juiste vorming van alle structuren die trunk NCC-afgeleide componenten ^3. Het ophelderen van de mechanismen van begeleiding voor romp NCC migratie is dan ook een kwestie van grote betekenis. Talrijke moleculen zijn gebleken NCC migratie ⁴ leiden. Zo worden trunk NCC's bekend te worden afgestoten door negatieve begeleiding signalen zoals Semaphorin, Efrine, en Slit liganden ^5-8. Echter niettot voor kort geen chemoattractanten van stam NCC geïdentificeerd ^9.

Conventionele benaderingen in vitro bestuderen van het gedrag van chemotactische hechtende cellen werken beste geïmmortaliseerd, homogeen verdeeld cellen, maar moeilijker om voor bepaalde primaire stamcelculturen die aanvankelijk missen een homogene verdeling en snel differentiëren (bijvoorbeeld NCC). Een benadering voor de verdeling van stam NCC voor chemotaxis studies meng is trunk NCC isoleren van primaire NT explantaat culturen til en replate ze bijna 100% confluent. Echter, deze plating aanpak vereist aanzienlijke hoeveelheden tijd en moeite om voldoende cellen explanteren, is hard, en distribueert romp nationale centra voor valsemunterij op een ongelijke wijze als in in vivo omstandigheden.

Hier rapporteren we een in vitro methode die in staat is chemotaxis en andere migrerende reacties van stam NCC evalueren zonder requirinGA homogene cel distributie. Deze techniek maakt gebruik van time-lapse imaging van de primaire, romp NCC onverstoord in een gemodificeerde Zigmond kamer (een standaard Zigmond kamer wordt elders ¹⁰ beschreven). Door belichting stam NCC aan de omtrek van de cultuur een chemotactant gradiënt loodrecht op hun voorspelde natuurlijke richtinggevoeligheid kunnen veranderingen in trekkende polariteit opgewekt door de toegepaste gradiënt chemotactant worden gedetecteerd. Deze techniek is goedkoop, vereist het kweken van twee NT explantaten per herhaling behandeling vermijdt harde cel heffen (zoals trypsine), bladeren trunk NCC in een soortgelijke verdeling in vivo omstandigheden, vermindert de hoeveelheid tijd tussen explantatie en experimenten (waardoor waarschijnlijk het risico van differentiatie), en maakt time-lapse evaluatie van talrijke trekkende eigenschappen.

Protocol

1. Dag 1: Isolatie van de romp neurale buizen voor overnachting cultuur op dekglaasjes

1. Incubeer chick eieren voor 56 uur bij 38 ° C. De eieren Verwijderen uit incubatie, licht besproeien ze met 70% Ethanol en laat ze drogen. Breek de eieren open in een UV-gesteriliseerde glazen draaiplateau.
2. Uittreksel elk embryo uit de dooier en plaats deze in kuiken Ringer's. Doe dit door eerst snijden rond zijn bloed eilanden met gebogen schaar, vandaar met stompe pincet, pak het embryo door de extra-embryonale membraan en plaats deze in een steriele plastic petrischaal met kuiken Ringer-oplossing.
3. Isoleer de stam van elke embryo door trimmen overtollige extra-embryonale membranen en craniale, vagale en sacrale axiale niveaus met een wolfraam naald (Fig. 1). Selecteer eerst ongeveer 9 embryo's die zijn tussen de fasen HH15-17 ^11. Voor podia HH15 en omhoog, de voorhersenen en achterhersenen assen vormen een scherpe hoek en dus het hoofd lijkt te caudaal kantelen. Bijstadium HH17, de staart knop aanwezig is en kantelt ventraal, maar bevat nog geen somieten. Met een wolfraam naald, afknippen extra-embryonale membranen tot ongeveer 2 mm van het embryo en knip de embryonale weefsels anterior tot 10 somiet. Verwijder ook alle caudale embryonale weefsels vanaf ongeveer de vijfde meest nieuw gevormde somiet.
4. Plaats de geïsoleerde stammen in embryonale Dispase (0,24 U / ml DMEM) en ze 1 h 15 min incuberen bij 37 ° C en _5% CO2. Zodra de koffers beginnen incubatie, beginnen met de voorbereiding 6 dekglaasjes (CS) voor het kweken van NT explantaten (stappen 1,5-1,8).
5. Spoel 6 CS in 70% ethanol (verdund in steriele ultrazuiver water) en laat ze drogen. Met behulp van een lab marker, teken een cirkel in het midden van elk CS, dat is ongeveer 1 cm in diameter (deze cirkel zal later helpen u te identificeren waar een fibronectine laag is aangebracht). Op hetzelfde gezicht van iedere CS, schrijf het woord "zijn" (of een andere asymmetrische woord of vorm) buiten de getrokken cirkel (dit zal helpen you bepalen of de gemarkeerde kant van de CS wordt naar boven of naar beneden).
6. Plaats elke CS in een aparte 40 x 10 mm steriele schaal met de gemarkeerde zijde naar beneden en laat de schotel om open te zitten onder een kiemdodende UV-lamp gedurende 10 minuten.
7. 60 ul van toepassing fibronectine (FN, 10 ug / ml DMEM) aan de ongemarkeerde oppervlak van de CS terwijl ervoor te zorgen het gehele gebied binnen de cirkel 1 cm bedekt. Plaats de gerechten bij 37 ° C gedurende 30 min en vervolgens voorzichtig aspireer het fibronectine uit elke CS.
8. Voeg 250 ul "culture" medium [DMEM met L-Glutamine (2 mM), penicilline (100U/ml), streptomycine (100 mcg / ml), en 8% foetaal bovine serum (FBS)] om de FN-beklede gebied van het CS. De schaaltjes die elk CS bij 37 ° C en 5% CO ₂ weer tot het NTs zijn geïsoleerd.
9. Breng alle bebroede embryo stammen tot een 5 cm glazen petrischaal met L15 medium en beginnen ontleden van elk NT met behulp van fijne tang en een wolfraam naald (Fig. 1). Carefully snijd langs de grens van het NT en somieten met een scherpe wolfraam naald terwijl ze voorzichtig dat u de NT beschadigen. Het is vaak gemakkelijker om te beginnen met het isoleren van elk NT uit de caudale meest uiteinde van de stam.
10. Selecteer 6 van de rechtste en de langste NT tot cultuur 's nachts (NTS tussen ongeveer 8 en 15 somieten lang worden aanbevolen). Behulp van een micropipet tip gevuld met kweekmedium, brengt elk van de 6 NT zijn eigen eerder bereide CS (van stap 1.5 tot 1.8). Zorg ervoor dat het NT niet zwevend blijft aan de oppervlakte. Als de NT zweeft, druppelen medium op het tot het zinkt met behulp van een micropipet.
11. Plaats elke schotel bij 37 ° C en 5% CO _{2 nachten.} Let erop elke NT binnen de FN-beklede gebied van zijn respectieve CS onmiddellijk voorafgaand aan het plaatsen van de schaal in de incubator (met de getrokken cirkel in stap 1.5 als referentie). Een micropipet kan worden gebruikt om beter de positie van elk NT indien nodig.
12. Plaats opminste 2 ml kweekmedium (zonder serum) in een steriele 15 ml centrifugebuis en incubeer overnacht bij 37 ° C en _5% CO2. Laat de kap iets losgeschroefd om de pH van het medium om 's nachts te passen toe te staan. Pre-incubatie van medium is belangrijk voor belvorming in een kamer, die de instelling van een moleculaire gradiënt kan verstoren voorkomen. Dergelijke "voorgeïncubeerde" medium moet in alle verdere stappen. Wanneer niet wordt gebruikt, moet dit medium worden incuberen bij 37 ° C.

2. Dag 2: Het laden van de gewijzigde Zigmond kamer en time-lapse analyse van celmigratie

1. Van de 6 NT gekweekte, selecteer de 3 culturen het meest geschikt voor analyse. Algemeen het NCC culturen die ten minste een lange rechte rand hebben worden gekozen (Fig. 2A). De 3 best culturen worden gebruikt voor het laden en film 3 gemodificeerde Zigmond kamers gedurende de dag, elk met een andere behandeling. Van de drie culturen, kiest u een voor loading de eerste kamer en de terugkeer van de anderen om de incubator voor later gebruik.
2. Met behulp van een wattenstaafje, een dunne, gelijkmatige laag vaseline rond de reservoirs en de brug van een gemodificeerde Zigmond kamer.
3. Met een wolfraam naald, verwijder het NT van de CS, terwijl de omringende NCC aan het oppervlak van de CS. Markeer de schotel met een pen om de oriëntatie van de rechtste rand van het NCC cultuur herinneren.
4. Plaats een paar druppels voorgeïncubeerde medium op de brug. Pak de CS met fijne tang, dep de rand van het CS tegen een Kimwipe om de meeste van de oude cultuur medium te verwijderen, dan onmiddellijk de CS dus plaats op de gewijzigde Zigmond kamer die de rechte rand van de cultuur te worden gefilmd wordt gecentreerd boven de lengte van de brug en ongeveer loodrecht op de brug-reservoir rand (Fig. 2A, B).
5. Behulp van een omgekeerde microscoop verplaats de rechte NCC grens aan de kant van de brug dichtst bij the reservoir dat de vermoedelijke chemotactant bevat (Fig. 2B, voor de controles dit komt overeen met welke reservoir is geplaatst seconde). Ook fijner lijn de rechte rand van de cultuur loodrecht op de brug-reservoir grens.
6. Voorzichtig, maar stevig op de CS in de vaseline aanwezig op de Zigmond kamer, zorg ervoor dat het volledig is afgedicht op de kamer, dan plaatst u extra vaseline langs de rand van de CS om verder te kunnen garanderen dat het luchtdicht zijn. Weer fijn stel de hoek van de NCC grens te corrigeren voor elke beweging tijdens het sealen.
7. Plaats het reservoir die niet bevatten vermoede chemotactant eerste (Fig. 2B). Doe dit door het laden van een 1 ml spuit (25 G x 1,5 inch aangehechte naald) met ongeveer 300 ul voorgeïncubeerde medium en injecteer het medium in het reservoir tot aan de volledige (terwijl ze ervoor dat er geen luchtbellen in het reservoir te genereren). Sluit het reservoir aan beide zijden met een sufficient hoeveelheid vaseline vóór het laden van de volgende reservoir.
8. Herhaal stap 2.7, behalve deze keer met behulp van voorgeïncubeerde medium dat de kandidaat chemotactant. Het is essentieel bij het ​​genereren van een moleculaire gradiënt over de cultuur altijd laden reservoir dat de molecule te testen na het laden reservoir zonder de geteste molecuul.
9. Plaats de geladen Zigmond kamer bij 37 ° C incuberen gedurende 1 uur vóór filmen. Beeld de rechte rand van de NCC cultuur gedurende 3 uur bij 90 s intervallen gedurende incubatie bij ongeveer 37 ° C (Fig. 2A, B). Voorafgaand aan het maken van een film, moet u de camera af te stemmen, zodat de rand van de foto's te verkrijgen zijn afgestemd en het aanraken van de rand van de brug die de laatste reservoir geladen grenst aan (fig. 2B, bovenste paneel; gestippelde vak vertegenwoordigt ideale positie imaging). Dit zal later software-analyse door het standaardiseren van de gerichtheid van de toegepaste moleculaire gradiënt en the afstand van het reservoir gefilmd in elke film geproduceerd.
10. Voor controles Herhaal stap 2.2-2.9 voor elk van de twee andere NCC culturen geselecteerd (in stap 2.1), maar vul elk reservoir met een geschikt medium. Een type control u beide reservoirs met voorgeïncubeerde medium zonder het molecuul te testen. Een tweede controle behandeling prime de brug met enkele druppels voorgeïncubeerde medium dat de vermoedelijke chemotactant vóór montage van de CS. Vervolgens laadt beide reservoirs met hetzelfde medium dat de verdachte chemotactant.
11. Gebruik ImageJ (NIH) Handmatige sporing (rsb.info.nih.gov / ij / plugins / track / track.html) en chemotaxis en Migration Tool v1.01 (www.ibidi.de / toepassingen / ap_chemo.html) plugins om bij te houden de migratie van perifere NCC's langs de rechte rand van de cultuur just afgebeeld en verschillende parameters van de verkregen trekkende trajecten (Fig. 2B-C) te analyseren.

3. Representatieve resultaten:

Een monster van cellen uit een film trajecten waar veel trunk NCC reageerden een kandidaat chemoattractant met de bovenstaande techniek wordt getoond (Fig. 2D). De meeste cellen in dit voorbeeld een positieve reactie vertoonde een netto beweging van de chemoattractant gradiënt (zie rood). Baangegevens kunnen worden gebruikt om andere eigenschappen van celmigratie en analyseren.

Om visueel een gradiënt toegepast in een gemodificeerde Zigmond kamer, een Alexa Fluor 488 conjugaat IgM (MW ~ 900 kDa) te evalueren werd geladen in het tweede reservoir van een gemodificeerd Zigmond kamer (bij ongeveer 40 ug / ml H ₂ O). Een gradiënt werd door 1 uur en nog wat aanwezig na 26 h, maar sterk verminderd met 50 h (Fig. 3). Als het molecuul te beproeven kleiner dan de toegepaste gradiënt will sneller af te breken dan wat wordt weergegeven.

Figuur 1. Explantatie van romp-niveau NT voor overnachting kweken op fibronectine gecoate dekglaasjes. Omdat stam NCC delamineren van het dorsale NT zich naast somieten 8-28, wordt dit segment van de NT geïsoleerd door microdissectie en overnacht gekweekt op met fibronectine gecoate CS mogelijk te maken emigratie van NCC van NT explantaat. Geïsoleerde NT die tussen 8-15 somieten lange en relatief recht zijn het best geschikt voor overnachting kweken als ze de neiging om NCC culturen leveren met een langere rechte randen. Gebieden van de neurale buis die tot andere neurale axiale staan ​​vermeld in een kleiner lettertype. s, somiet.

Figuur 2. Methode voor het evalueren van de migratie van geëxplanteerde romp NCC'smet een aangepaste Zigmond kamer. (A) Verlengd trunk NCC culturen worden bereid door overnacht kweken van NTS en resulterende NCC culturen met tenminste een lange rechte rand geselecteerd voor experimenten. De langste rechte rand van een geselecteerd cultuur wordt vervolgens loodrecht op de brug-reservoir grens en daarom evenwijdig aan de vector van het toekomstig toegepast gradiënt. (B) Nadat de positie van de NCC cultuur fijninstelorgaan op Zigmond kamer en afdichting het dekglaasje naar de kamer, is het cupje. Bij het ​​testen chemotaxis, het reservoir niet bevat de vermoedelijke chemotactant (-) geladen eerste en verzegeld. Vervolgens wordt het andere reservoir geplaatst met de vermoedelijke chemotactant (+) en verzegeld. Perifere NCC's langs de eerder gekozen grens kunnen vervolgens worden afgebeeld en bijgehouden met de Handmatige sporing plugin voor ImageJ (onderste paneel). (C) Tal van trekkende kenmerken als reactiede toegepaste gradiënt kan beoordeeld worden op trackinggegevens. Zo kan een chemotaxis index worden berekend door een cel verplaatsing langs de x-as de totale afstand is gemigreerd. (D) Een voorbeeld van een aantrekkelijk antwoord wordt door een cel traject plot aanvankelijk gegenereerd door de Chemotaxis en migratie Tool plugin voor ImageJ. Het beginpunt van elke traject op de oorsprong (0,0). Merk hoeveel cellen migreren naar de chemoattractant source.The zwaartepunt van alle cellen op hun plaats (blauw kruis alle cellen gelijk gewicht) is dichter bij de bron chemoattractant. NCC, neurale cellen, Red tracks, cellen die migreerden naar het reservoir geladen met een vermoedelijke chemoattractant, Black tracks, cellen die weg gemigreerd; (+), hogere chemotactant concentratie (-), lagere chemotactant concentratie.

Figuur 3. intensiteitsprofielen de brug van een gemodificeerd Zigmond kamer op verschillende tijdstippen na de toevoeging van een Alexa Fluor 488 conjugaat IgM. De kamer werd geladen op een soortgelijke wijze als beschreven in het protocol met de belangrijkste uitzonderingen voorgeïncubeerde water (plaats gepreïncubeerde medium) werd gebruikt om het antilichaam verdund tot 40 ug / ml en kleine luchtbellen aanwezig aan de uiteinden van de brug (weg van het deel waar bovenstaande intensiteitsprofielen genomen zijn). Aanvankelijk geen gradiënt aanwezig was in de meeste van de brug. Uiterlijk op 1 ha gradiënt werd opgericht en bleef aanwezig tot 26 h. Met 50 h aanwezigheid van de gradiënt inconsistent op verschillende gebieden van de brug, en indien aanwezig, is de steilheid van de gradiënt sterk verminderd. Alle profielen werden gegenereerd uit een identieke schijfje over de brug (van de ene brug-reservoir grens naar de andere) met behulp van AxioVision 4,6 software. Merk op dat zelfs als de luchtzakken aanwezig waren, werd de gradiënt niet verstoord. Hoog, hoge intensiteit met laag met lage intensiteit, x-as afstand over gehele breedte van de brug (2 mm) (+), reservoir geladen met Alexa Fluor 488 conjugaat IgM, (-), reservoir niet geladen met het conjugaat.

Figuur 4. Aangepast Zigmond kamer specificaties. Weergegeven is een diagram van het gemodificeerde Zigmond kamer die hier samen met de dimensionale specificaties (± 0,2 mm). Metingen kunnen matig worden aangepast om aan de individuele voorkeuren.

Aanvullende Protocol: Fabricage van een Modified Zigmond Kamer

Raadpleeg figuur 4 als referentie voor het protocol hieronder:

1. Koop een blad van 3/16 "dik gepolijst acryl (4,45 mm werkelijke dikte).
2. Met behulp van een tafel zag, snijd kamer blanks extra groot om deruwe afmetingen van 33,25 mm x 64,57 mm. Hiermee 3,175 mm extra materiaal voor de bewerking.
3. Stel de kamer leeg op een bankschroef. Met een freesmachine en een 6,35 mm (1/4 ") frees bit, nabewerken van de zijkanten van de kamer om de exacte afmetingen: 30,07 mm x 61,39 mm.
4. Plaats de kamer leeg op de freesmachine en zoek het midden van de lege langs zowel de x-en y-assen met een kantentaster, dan nul de locatie in het centrum.
5. Verwerven kamerhoogte (z-as) door op de frees bit aan het bovenoppervlak en de hoogte nul.
6. Met een 3,91 mm (0,154 ") frees bit te verhelpen bit 3,03 mm langs de x-as (positieve richting) voor het eerste reservoir. Beginnen bewerking in de kamer tot een diepte van 2,84 mm, terwijl die langs de y-as (positieve richting) tot 7,62 mm (0,300 ") en doorlopen tot 7,62 mm (0,300") in de andere (negatieve) richting een volledige reservoir lengte van 15,24 mm (0,600 "). Compenserende bit tot 3,03 mm (0,119 ") langs de x-as (negatieve richting) en herhalen voor de tweede reservoir.
7. Plaats de kamer op de rand en boor een gat van 1,09 mm (0,043 inch) boortje op het einde van elk reservoir (4 totaal) dat het einde van het reservoir aangesloten op de zijde van de kamer voor het laden medium tijdens proeven.
8. Goed Geniet van de kamer in een warm sopje te helpen elke chemische verontreinigingen te verwijderen.
9. Geniet en goed spoelen de kamer in dubbel gedestilleerd water om alle zeep te verwijderen. De kamers zijn nu klaar voor gebruik zoals hierboven beschreven.

Discussion

Het uitvoeren van chemotaxis onderzoek op stam NCC heeft bewezen een uitdaging voor een aantal redenen. Trunk NCC's vormen een heterogene stamcel populatie die zal differentiëren als gekweekte lange termijn, daarom romp NCC's moet worden verkregen van de primaire explantatie van de stam-niveau NT. Conventionele methoden om de chemotactische respons van homogeen verdeeld celpopulaties in vitro bestuderen zijn moeilijk te testen op stam NCC omdat ze eerst dient cellen geïsoleerd en homogeen opnieuw uitgep...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
DMEM	Omega Wetenschappelijke	DM-22
Penicilline streptomycine-oplossing	Omega Wetenschappelijke	PS-20	100X Stock Concentratie
L-Glutamine	Omega Wetenschappelijke	GS-60	100X Stock Concentratie
Fetal Bovine Serum	Omega Wetenschappelijke	FB-11	Lot # 105247 (of een ander dat vergelijkbaar is)
Gewijzigd Zigmond kamer	Huisgemaakte	N / A	Reservoir volume: ~ 160 ul ea, voor aanvullende specificaties, zie Fig. 4 en de aanvullende fabricage protocol
Celkweekschaal	Denville	T6040	40 x 10 mm
Fibronectine	BD	354008	10X Stock voorbereid door verdunning 1 mg FN in 1 ml H2O en 9 ml DMEM
Dekglaasjes	Visser	12-548 B-	Voorgereinigde; 22 x 22 mm
L15 medium	Thermo Scientific	SH30525.02
Vaseline	Comforts	011110794642	100%
Centrifugebuis	Biologix	10-9.152	15 ml
Dispase	Cell Systems	4Z0-850	10X Stock Concentratie
Injectiespuit	BD	309602	1 ml
Naald	BD	305127	25 G x 1,5 inch
Alexa Fluor 488-IgM	Iknvitrogen	A21042	Stock is 2 mg / ml, 7 mol kleurstof / mol IgM
Ontleden tang	FST	Misc.	Dumont # 5 of 55; rechte tip, roestvrij staal of titanium
Tungsten Naald	N / A	N / A	Home made, geplaatst in een penhouder
Blunt Forceps	Tiemann	160-18	Gebruikt voor het overbrengen embryo's Ringer's uit eidooier