Een functioneel geheel Bloed Test van de levensvatbaarheid van Mycobacteriën Meet, met behulp van Reporter-Gene Tagged BCG of M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Samenvatting

We beschrijven een alternatieve benadering voor de opsomming van mycobacteriën In vitro, Die reporter-gen maakt gebruik van gelabeld mycobacteriën in plaats van kolonievormende eenheden (CFU). "Overleven" van organismen als gastheer response-markers worden gelijktijdig gemeten, het verstrekken van een low-cost, veelzijdig en functioneel systeem voor de studie van gastheer / pathogeen interacties in de context van tuberculose.

Samenvatting

Functionele testen al lang een belangrijke rol gespeeld bij het meten van de immunogeniciteit van een bepaald vaccin. Dit wordt conventioneel uitgedrukt als serum bactericide titers. Studies van serum bactericide titers in reactie van vaccins voor kinderziekten hebben ons in staat te ontwikkelen en cut-off te valideren niveaus voor beschermende immuunrespons en dergelijke cut-offs zijn in routine gebruik. Dergelijke testen zijn naar voren opgenomen in de routine evaluatie van de vaccins die in de eerste plaats cel-gemedieerde immuniteit in de vorm van effector T-cel responsen, zoals tuberculose vaccins induceren. In het diermodel, is de prestatie van een bepaalde kandidaat-vaccin regelmatig geëvalueerd in gestandaardiseerde bactericide testen, en alle huidige nieuwe TB-vaccin kandidaten zijn onderworpen aan deze stap in de evaluatie voorafgaand aan een menselijke proeven fase. De beoordeling van de immunogeniciteit en daarom de waarschijnlijkheid van beschermende werkzaamheid van nieuwe anti-TB-vaccins moet een soortgelijke stapsgewijze evaluatie idealiter nu ondergaan in de menselijke modellen, inclusief metingen in bactericide assays.

Bactericide assays in het kader van tuberculose vaccins onderzoek zijn al goed ingeburgerd in de diermodellen, waar ze worden toegepast op potentieel veelbelovende kandidaat-vaccins scherm. Reductie van bacteriële belasting in verschillende organen fungeert als de belangrijkste uitlezen van immunogeniciteit. Er zijn echter geen dergelijke tests zijn verwerkt in klinische studies voor nieuwe anti-TB vaccins tot nu toe.

Hoewel er nog steeds onzekerheid over de precieze mechanismen die leiden tot het doden van mycobacteriën in de menselijke macrofagen, is de interactie van macrofagen en T-cellen met mycobacteriën duidelijk nodig. De test beschreven in dit document vertegenwoordigt een nieuwe generatie van bactericide testen die studies van dergelijke belangrijke cellulaire componenten mogelijk maakt met alle andere cellulaire en humorale factoren aanwezig zijn in bloed, zonder het maken van veronderstellingen over de relatieve individuele bijdrage. De assay beschreven door onze groep maakt gebruik van kleine hoeveelheden van bloed en is al toegepast in studies met volwassenen en kinderen in TB-endemische instellingen. We hebben laten zien immunogeniciteit van het BCG-vaccin, de toegenomen groei van mycobacteriën bij HIV-positieve patiënten, evenals het effect van anti-retrovirale therapie en vitamine D op mycobacteriële overleving in vitro. Hier vatten we de methodologie, en presenteren onze reproduceerbaarheid gegevens met behulp van dit relatief eenvoudige, goedkope en veld-vriendelijke model.

Let op: Definities / Afkortingen

BCG lux = M. bovis BCG, Montreal stam, getransformeerd met plasmide shuttle pSMT1 het dragen van de luxAB genen van Vibrio harveyi, onder de controle van de mycobacteriële GroEL (HSP60) promotor.
CFU = Colony Forming Unit (een maat voor mycobacteriële levensvatbaarheid).

Protocol

1. Voorbereiding van de BCG lux reporter mycobacteriën voorraad

1. Grow BCG lux (M. bovis BCG Montreal stam getransformeerd met het plasmide pSMT1 shuttle) met schudden bij max. 200 omw tot medio logaritmische fase in Middlebrook 7H9 bouillon met 0,2% glycerol, 0,05% Tween 80 en 10% ADC verrijking.
2. Bereid 1 ml van een 1:10 verdunning van BCG lux cultuur in steriele PBS in een luminometer buis (900μl PBS + 100μl BCG lux cultuur) in tweevoud.
3. Laad buis met N-decyl aldehyde (luciferase enzym substraat) op de achterkant van de machine en zorgen voor de deksel is beveiligd en buizen op hun plaats.
4. Prime luminometer injector met substraat via het eerste programma, ingesteld op 100 UCL x 3 injecteer in elk van de drie lege priming buisjes geplaatst in de luminometer.
5. Laad de twee buizen in de luminometer en neem metingen via een programma ingesteld op het injecteren van 100 UCL van de ondergrond in elke buis en lezen voor 20 sec in 1 sec intervallen.
6. Als de voorraad is 1x10 ⁸ RLU / ml tot 2x10 ⁸ RLU / ml (dit duurt ongeveer 3-4 dagen van de groei) bereikt, voeg een gelijk volume van steriele 30% glycerol aan de cultuur in een 50 ml falcon buis en meng.
7. Aliquot 1,5 ml volumes in gelabelde 2ml schroefdop microbuisjes en bewaar bij -80 ° C.

2. Het bepalen van voorraad RLU / CFU correlatie en de inhoud van aliquots

1. Voeg 15 ml van Middlebrook 7H9 kweekmedium met 10% ADC aanvulling op een 200 ml erlenmeyer met een geventileerde dop.
2. Voeg 15μl van hygromycine en 30μl van 20% Tween.
3. Verwijder een flacon van BCG lux uit de vriezer en ontdooien bij kamertemperatuur (RT) in de veiligheidskast. Voeg de inhoud van de flacon aan het medium en draai de dop.
4. Incubeer met schudden bij max. 200 omw bij 37 ° C gedurende 4 dagen.
5. Op elke dag, make-up serie 10-voudige verdunningen (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000 en 1:100.000) voor de bepaling CFU.
6. Stel dezelfde verdunningen parallel en dupliceren om licht te bepalen (zie deel 1.2 tot 1.6).
7. Bereid twee 3-compartimenten platen van Middlebrook 7H11 agar (1 liter vloeibaar medium dat 0,5% glycerol, 10% OADC te vullen, 1 ml van 20% Tween en 1 ml hygromycine).
8. Plaat uit 100μl van elke verdunning op een segment van elke plaat met behulp van aparte spreaders, het verdelen van de vloeistof gelijkmatig over de individuele kamer.
9. Seal elk bord met parafilm, plaats in een steriele plastic zak, afdichting met autoclaaf tape, en incubeer bij 37 ° C gedurende 2 weken met deksel naar beneden.
10. Inspecteer regelmatig tot CFU's worden weergegeven (2-3 weken).
11. Te tellen kolonies, verwijder de platen uit de couveuse en plaats deze op een kolonie teller. Bereken het gemiddelde voor elke verdunning van de dubbele platen.
12. Bereken de RLU / CFU-verhouding met vergelijkbare RLU en CFU telt voor elke verdunning. De verhouding moet tussen de 3 en 5 RLU / CFU.

3. Voorbereiding van de BCG lux cultuur voor enting in volbloed

1. Voeg 15 ml van Middlebrook 7H9 kweekmedium met 10% ADC aanvulling op een 200 ml erlenmeyer met een geventileerde dop.
2. Voeg 15μl van hygromycine en 30μl van 20% Tween.
3. Verwijder een flacon van BCG lux uit de vriezer en ontdooien bij kamertemperatuur in de veiligheid kast. Voeg de inhoud van de flacon aan het medium en draai de dop.
4. Incubeer met schudden bij max. 200 omw bij 37 ° C gedurende 2 tot 4 dagen.
5. Bereid 1 ml van een 1:10 verdunning van BCG lux cultuur in steriele PBS in een luminometer buis (900μl PBS + 100μl BCG lux cultuur) in tweevoud.
6. Prime luminometer met substraat (zoals hierboven beschreven), voorzichtig vortex van de twee buizen en laden in de luminometer en neem metingen (zoals hierboven beschreven).
7. Gebruik deze lezing te verdunnen af van de cultuur in PBS tot een equivalent van 7x10 ⁶ RLU (dit wordt een inoculum van ongeveer 2x10 ⁵ CFU / ml bloed en een verhouding van BCG te geven aan monocyten van ongeveer 1:1, uitgaande van een monocyt telling van geven ongeveer 2x10 ⁵ tot 4x10 ⁵ monocyten per ml bloed).

4. Voorbereiding van de volbloed

1. 3 tot 5 ml van veneuze bloed in een buisje met conserveermiddel-vrije heparine.
2. Breng het bloed aan een 50 ml falcon buis en verdunnen met een gelijk volume van RPMI 1640 met glutamine en 25mm HEPES (geen pen / strep).
3. Aliquot 900μl van verdund bloed in drievoud in steriele bijou buizen voor elk tijdstip (6 tubes in totaal:. 3 voor 0 uren en 3 voor 96hrs instellen van extra buizen voor extra tijdstippen, indien nodig.
4. Aliquot 900μl van Middlebrooks 7H9 kweekmedium met 10% ADC aan te vullen + 50μg/ml hygromycine (hetzelfde medium als gebruikt om de cultuur van de BCG lux) in tweevoud voor de groei controles.
5. Voeg 100μl van het verdunde BCG lux aan elke buis van bloed, en om de 2 groei van controlebuizen.
6. Meng goed en de drie bijous voor de 96-uurs tijd-punt en de 2 groei controles aan hun zijde in de schommelstoel incubator bij 37 ° C plaats, 20 omw / min (CO ₂ niet vereist).

5. Het meten van luminescentie (bij 0hr en 96hrs)

1. Centrifuge de drie bijous bij 2000g gedurende 10 minuten.
2. Zorgvuldig 300μl van het supernatans verwijderen zonder de pellet te verstoren en de plaats in 2 ml schroefdop microbuisjes te vriezen bij -80 ° C voor verdere cytokine analyse.
3. Voeg 300μl van PBS aan elk bijou om het volume van het supernatans verwijderd te vervangen.
4. Zuigen de inhoud van elke bijou in de overeenkomstige 50 ml Falcon buis en voeg 8ml gedestilleerd water aan elke buis. Begin een timer voor 10 minuten.
   Nb: Dit is een tijd-gevoelige stap, en dit incubatie dient niet langer dan 10 minuten, worden vanaf het moment dat de cellen eerst in contact komen met water.
5. Spoel elk bijou met 2 ml gedestilleerd water en vortex gedurende 5 seconden voordat kantelen in de overeenkomstige falcon buis.
6. Aan het einde van de 10 minuten incubatie, centrifuge de valk buizen bij 2000g gedurende 10 minuten.
7. Giet supernatant in Surfanios ontsmettingsmiddel.
8. Voeg een paar glazen kralen aan elke pellet en vortex.
9. Voeg 1 ml steriele PBS aan elke buis en vortex.
10. In luminometer buizen, maken 1:10 verdunningen voor elk monster in duplo met PBS (900μl PBS + 100μl steekproef) en op het 96-uurs tijd-punt. Maak dezelfde verdunningen voor elk van de groei van controles.
11. Voorzichtig vortex de buizen en laden in de luminometer en neem metingen (zoals hierboven beschreven)
    NB: Lezingen tussen drie exemplaren van hetzelfde monster moet binnen 15% van elkaar.

6. Representatieve resultaten:

Het is belangrijk om bacteriën te gebruiken in logaritmische fase van groei voor de volbloed lux analyses, dat wil zeggen gegroeid 48-72 uur voorafgaand aan de inoculatie van de monsters, zoals metabolische activiteit is niet optimaal als een van beide direct uit de vriezer of in de stationaire fase. De voorafgaande groei moet worden gestandaardiseerd voor een reeks experimenten om ofwel 48 of 72 uur om de variabiliteit te voorkomen. Figuur 1 toont de groei curve van een vertegenwoordiger cultuur van BCG lux. De verdubbelingstijd is ongeveer 24 uur tot stationaire fase wordt bereikt.

Figuur 1. Vertegenwoordiger groeicurve van BCG lux meer dan 96 uur in 7H9 medium en correlatie van RLU en CFU.

Hoewel RLU values ​​altijd correleren met CFU, kan het aantal RLU overeenkomt met een enkele CFU variëren, afhankelijk van de voorraad, die is waarom het is een goede gewoonte om dezelfde frozen voorraad te gebruiken gedurende een reeks experimenten om een ​​consistente multipliciteit van infectie garantie ( MOI).

Tabel 1 toont een voorbeeld van een ruwe datum op het moment van inoculatie (T ₀₎ en op 96 uur. De groei ratio's worden berekend volgens de formule T ₉₆ / T _0, maar ook andere tijdsintervallen kunnen natuurlijk ook worden gemeten. Het is echter niet raadzaam om de culturen gebruiken buiten 96 uur, omdat er aanzienlijke celdood optreedt.

Tabel 1. Voorbeeld van ruwe data op het moment van inoculatie (T0) en na 96 uur (T96) en de berekende groei ratio van 3 volwassen donoren.

Afhankelijk van de beschikbare antigeen-specifieke geheugen reacties en mogelijk ook neutrofielen, de groei ratio's variëren tussen individuen, zoals hier afgebeeld in figuur 2 in het bloed van kinderen met en zonder HIV-infectie. Gemiddeld jonge kinderen hebben een hogere groei van ratio's dan volwassenen, tuberculinehuidtest (TST) + ve individuen hebben een lagere groei dan de ratio's TST-ve individuen, en HIV-geïnfecteerde patiënten hebben een hoge groei van ratio's als gevolg van de deficiëntie van CD4 T-cel populatie, een van de belangrijkste bemiddelaars van cellulaire immuunresponsen op mycobacteriën.

Figuur 2 Inter-donor variabiliteit:. Groei verhoudingen van T ₀ versus 96 uur voor een set van de patiënten, afhankelijk van de onderliggende HIV-status.

Reproduceerbaarheid van de groei ratio's over een periode van tijd is weergegeven in figuur 3, die voortvloeit uit 64 donoren bloedde twee keer over een periode van 12 maanden en van een enkele donor bloedde herhaaldelijk voor controle experimenten samengevat. Mogelijke oorzaken van variabiliteit kan worden veranderingen in de mycobacteriële overgevoeligheid of variabiliteit binnen het niveau van gastheer cytokines, zoals waargenomen in vele bioassays.

Figuur 3. (A) Single donor op 12 keer meer dan 12 maanden. (B) meerdere (64) donoren op twee keer meer dan 12 months.

Discussie

Bactericide assays in het kader van tuberculose vaccins onderzoek zijn goed ingeburgerd in diermodellen, waar ze worden toegepast op potentieel veelbelovende kandidaat-vaccins scherm. Reductie van bacteriële belasting in verschillende organen fungeert als de belangrijkste uitlezen van immunogeniciteit.

De eerste generatie van de menselijke bactericide assays werden ontworpen met behulp van macrofagen alleen, die besmet zijn met M. tuberculose. CFU diende als de belangrijkste uitleze...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagens	Vennootschap	Geen kat
BCG lux	Verschillende	n / a
Middlebrook 7H11 agar	Becton Dickinson	283810
Middlebrook 7H9 bouillon	BD Biosciences	271310 (500g)
Middlebrook ADC verrijking	BD Biosciences	212352
Middlebrook OADC aanvulling	Becton Dickinson	212240
Tween 80	Sigma Aldrich	274364
Glycerol	Sigma Aldrich	G5150
Hygromycine B	Roche	10843555001 (20ml)
N-decyl aldehyde	Sigma	D7384-100G
Ethanol (> 99,7%)	VWR	101077
Steriel PBS	In House	n / a
RPMI-1640 met L-Glutamine, 25mm HEPES	Sigma	R0883
Steriel gedistilleerd water	In House	n / a
Uitrusting
Tube luminometer (injecteerbare poort verplicht)	Berthold AutoLumat LB953 of single-tube luminometer Sirius
Luminometer buizen, 12 x 75mm, pyrex randloos	Corning van VWR	99445-12
Erlenmeyers met geventileerde caps, steriel polycarbonaat 250ml	Corning via Fisher Scientific	2150329
BD Vacutainer bloedafname (zonder conserveermiddel heparine)	BD	367676
50ml Falcon buizen, conisch	BD	352077
7ml STERILIN exemplaar polypropyleen bijou buizen	VWR	99445-12
STERILIN Universal containers (30 ml)	Laboratoriumonderzoek LTD	128C
Glazen kralen 2mm diameter	SigmaAldrich	Z143928
10 ml pipetten en pipet jongen	een
1000μl en 200μl pipetten en filter tips	een
Algemeen laboratoriumapparatuur:
Klasse II veiligheidskabinet kast
Koelkast (4 ° C)
Centrifuge
Rocking shaker platform (180 0) tot buizen mix
Orbital Shaker incubator ingesteld op 37 ° C voor het opgroeien bacterieculturen