Imaging Geur-Opgeroepen activiteiten in de muis bulbus olfactorius met behulp van optische reflectie en autofluorescentie Signalen

Samenvatting

Dit artikel geeft de protocollen van de intrinsieke optische signalen en flavoproteins autofluorescentie signalen beeldvorming in kaart geur-opgeroepen activiteiten op het oppervlak van het reukorgaan in muizen.

Samenvatting

In de hersenen activeert sensorische stimulatie verdeelde populaties van neuronen waaronder functionele modules die deelnemen aan de codering van de stimulus. Functionele optische beeldvorming technieken zijn voordelig voor de activering van deze modules in sensorische cortex met een hoge ruimtelijke resolutie te visualiseren. In deze context, endogene optische signalen die voortvloeien uit de moleculaire mechanismen die verband houden met neuroenergetics zijn waardevolle bronnen van tegenstelling tot de ruimtelijke kaarten van zintuiglijke prikkels over grote velden in de knaagdieren hersenen vast te leggen.

Hier presenteren we twee technieken gebaseerd op veranderingen van de endogene optische eigenschappen van het hersenweefsel tijdens de activering. Eerst de intrinsieke optische signalen (IOS) worden geproduceerd door een lokale verandering in rood licht reflectie als gevolg van: (i) de absorptie door veranderingen in het bloed zuurstof niveau en bloedvolume (ii) foton verstrooiing. Het gebruik van in vivo IOS om ruimtelijke kaarten registreren begon in het midden van de jaren 1980 met de observatiover van optische kaarten van whisker vaten in de rat en de oriëntatie kolommen in de kat ^een visuele cortex. IOS beeldvorming van het oppervlak van de knaagdieren belangrijkste bulbus olfactorius (OB) in reactie op de geurstoffen werd later aangetoond door Larry Katz groep ^2. De tweede benadering is gebaseerd op flavoprotein autofluorescentie signalen (FAS) als gevolg van veranderingen in de redox toestand van deze mitochondriale metabole intermediairen. Meer bepaald, is de techniek die gebaseerd is op de groene fluorescentie als gevolg van geoxideerde toestand van flavoproteins wanneer het weefsel wordt opgewekt met blauw licht. Hoewel dergelijke signalen waren waarschijnlijk een van de eerste fluorescerende moleculen opgenomen voor de studie van de hersenactiviteit door de pionier studies van Britton Kansen en collega's ^3, was het niet tot voor kort dat ze zijn gebruikt voor het in kaart brengen van de hersenactiviteit in vivo. FAS beeldvorming werd voor het eerst toegepast op de somatosensorische cortex bij knaagdieren in reactie op achterpoot stimulatie door de groep Katsuei Shibuki's ^4.

De olfactorische systeem is van essentieel belang voor het voortbestaan ​​van de overgrote meerderheid van de levende soorten, omdat het maakt een efficiënte opsporing en identificatie van chemische stoffen in het milieu (voedsel, roofdieren). De OB is het eerste relais van olfactorische informatieverwerking in de hersenen. Het ontvangt afferente projecties van de olfactorische primaire sensorische neuronen die vluchtige geurstof moleculen te detecteren. Elke sensorische neuron drukt slechts een type odorant receptor en neuronen die hetzelfde type receptor sturen hun zenuwen processen naar dezelfde goed gedefinieerde microregions van ~ 100 urn ³ samengesteld van discrete neuropil, de olfactorische glomerulus (afb. 1). In de afgelopen tien jaar heeft IOS beeldvorming bevorderd de functionele exploratie van de OB ^{5, 6, 7,} die is uitgegroeid tot een van de meest bestudeerde zintuiglijke structuren. Het in kaart brengen van OB activiteit met FAS imaging is nog niet uitgevoerd.

Hier, we tonen de opeenvolgende stappen van een efficiënt protocol voor IOS en FAS beeldvorming aan geur-activiteiten opgeroepen kaart in de muis OB.

Protocol

1. De voorbereiding van het dier voor beeldvorming (volgens de Europese aanbevelingen voor de zorg en het gebruik van proefdieren, 86/609/EEG richtlijn)

1. 6 tot 8 weken oud C57Bl6 mannelijke muizen worden verdoofd met een cocktail van ketamine (10mg/kg) en xylazine (100mg/kg) intraperitonealy geïnjecteerd. Operatie begint wanneer de muis niet meer reageert op achterpoot knijpen. Gedurende het hele experiment is het dier op een verwarmings-pad. Lichaamstemperatuur is continu bewaakt en gehandhaafd op 37 ° C. Diepte van de anesthesie is gedurende de gehele operatie en imaging sessie door het controleren van de afwezigheid van ledematen te trekken. Een subcutane injectie van 20% van de initiële narcose cocktail is anders toegediend.
2. Met behulp van klippers, verwijder het haar van de hoofdhuid. Reinig de blootgestelde huid van de resterende haren met behulp van steriel gaas gedrenkt met een zoutoplossing.
3. Plaats de muis in de stereotaxisch frame. De snuit moet in hetzelfde vlak als de achterkant van het hoofd,om de oppervlakte van de bulbus olfactorius ingesteld op de horizontale. Secure stevig het oor en neus bars om bewegingen te voorkomen tijdens de beeldvorming.
4. Toe te passen oogzalf op de ogen van de dieren aan het drogen en pijn te voorkomen.
5. Desinfecteer alle chirurgische instrumenten met 70 ° ethanol en de hoofdhuid met opeenvolgende bochten van betadine.
6. Op de huid over de schedel te verwijderen, te beginnen door het maken van een incisie in de huid met een schaar aan de achterkant van het hoofd tussen de oren. Snij vervolgens aan beide kanten naar de basis van het oor en in de achterwaartse richting naar het voorhoofd langs de oogleden. Finish het verwijderen van de hoofdhuid door het snijden van de huid op de top van de snuit dicht bij de neus bar.
7. Onder binoculaire waarneming, gebruik dan een wattenstaafje gedrenkt met zoutoplossing om het periost zachtjes los op de top van de schedel. Gebruik een pincet om de resterende weefsel te verwijderen en het oppervlak van de schedel schrapen met een scalpel een schone voorbereiding te hebben.
8. De OB is een symmetrische structuur bestaat uit twee hemibulbs die gelegen zijn tussen de oogleden. Ze zijn beperkt in de rostrale en in de caudale richting door een veneuze sinus, en gescheiden door de pijlnaad. Leg een stukje van absorbeerbare gelatine spons doordrenkt met gedestilleerd water op het bot boven de OB. Het is belangrijk om dit bot gebied vochtig gedurende het experiment.

2. Voorbereiden van de craniale venster

1. Haal de gelatine spons en beginnen met het voorzichtig schrapen het bot met n ° 10 scalpel. Houd een constante hoek van 45 ° tussen het blad en het bot, en verplaats het blad van de oogleden aan de sagittale kant van de bollenstreek. Doen verticale druk niet van toepassing op het bot of krassen op het bot boven de veneuze sinus.
2. Tijdens het proces dunner, stop elke 5min en plaats een gehydrateerd gelatine spons op het bot af te koelen van de voorbereiding. Wattenstaafje de schedel met de spons aan het bot stof te verwijderen.
3. Houden vegen enkoeling als alternatief tot het visualiseren van de trabekels, de sponsachtige bot laag. De fijne bloedvaten van de OB moet zichtbaar zijn in dit stadium. Stop krassen op het bot, en start met de scalpel van de tip loodrecht op "tekenen" een rechthoekig gebied omsluiten van de OB. In dit stadium n ° 11 scalpel kan worden gebruikt. Houd de operatie binnen de grenzen van de veneuze sinussen die moeten worden veilig van een scalpel een beroerte.
4. Dig geleidelijk de gevormde rechthoekige sleuf door gebruik te maken opeenvolgende bewegingen van de scalpel. Veeg de tip van de scalpel periodiek aan het schoon en houd het scherp. Wees extra voorzichtig met de diepte van de tip om te voorkomen dat het aanraken van de dura oppervlak.
5. Om een ​​gevoel van de dikte van het resterende bot te krijgen, duw hem met de punt van een pincet. Als het bot flap plooien onder druk, ga dan naar de volgende stap.
6. Onder een druppel zoutoplossing, horizontaal gebruik maken van de tip van de scalpel gericht op tillen het bot flap. Het verwijderen van de klep gedaan moet worden carefully om te vermijden dat de resterende bot.
7. Zodra de OB het oppervlak is blootgesteld, te controleren op de afwezigheid van bloeden of bloedvaten anastomose. Verwonden van de dura of het weefsel oppervlak zal verminderen de kans op het verkrijgen van optische signalen. Veeg het gebied met een gelatine spons gedrenkt in een zoutoplossing om de lamp vochtig te houden.
8. Van toepassing zijn polyacrylaat tandheelkundig cement om een ​​goed formulier op het bot rondom het raam.
9. Breng een druppel laag smeltpunt agarose (1,2%) over de dura, en zet een steriele dekking van glas op de afmetingen van het venster. Tijdens de opnamesessie, kan een kleine hoeveelheid van de agarose worden toegevoegd, om de uitdroging te compenseren. Agarose wordt voorkomen dat de OB te bewegen met de ademhaling en een plat oppervlak voor optische beeldvorming te bieden.

3. Optische beeldvorming setup voor reuk-activiteit in kaart brengen van

1. De olfactorische stimulatie moet nauwkeurig zijn omschreven in de tijd en de intensiteit van het gebruik van een olfactometer. We maken gebruik van een aangepaste aangepaste versie van multivial perfusie-systeem Valvebank 8II van Automatiseer Scientific geassocieerd met een eenvoudige luchtcompressor (gecomprimeerde ademlucht geschikt zou zijn als ook). Dit systeem zorgt voor accurate en snelle externe klep te controleren. Oplossingen van pure geurende worden verdund in minerale olie op de gekozen concentratie. Het activeren van de dorsale OB aldehyden, zoals hexanal worden vaak gebruikt. Een exacte volume van de verdunde odorant (20 tot 50μl) is geladen op een filtreerpapier en geplaatst in een spuit reservoir. Door de perfusie-systeem, wordt de druk geregeld lucht geleverd aan het systeem, zorgt voor een constante snelheid van geodoriseerde lucht flux levering aan het dier neus tijdens de opening van de afsluiter. Geurstof wordt geleverd door middel van een Tygon R-3603 Vacuum Tubing (Saint-Gobain Corporation) die de lucht bij een debiet van ~ 1000ml/min. Vermijd besmetting tussen geur-en residuele hoeveelheden van geurende in de slang. Indien beschikbaar, kan de reproduceerbaarheid van de geurstof stimulus te controgelogen door het gebruik van een vlam ionisatie detector (microFID 2020 Photovac).
2. De optische opstelling is ingeschakeld. Het bestaat uit een gekoelde interlaced 12 bits CCD-camera (ORCA AG Hamamatsu) geassocieerd met een fluorescentie stereomicroscoop (Leica MZ16), een computergestuurde olfactometer en gestabiliseerd excitatie-lampen met de juiste bandpass interferentie filters. Een regeling beschrijft onze opstelling wordt gegeven in figuur 2. Voor Intrinsieke optische signalen Imaging (IOSI), een 200W halogeen lamp (Oriel QTH) gekoppeld aan een fiber ring licht (Schott) aangesloten rond de microscoop doel worden gebruikt om stabiele en gelijkmatige verlichting te bieden. Voor Flavoprotein autofluorescentie Signals Imaging (fasi), een 150 W metaal halide lamp (Leica) met een 5mm kern vloeibaar lichtgeleider voorzien in een nog gelokaliseerd excitatie van de fluorescentie door de epi-verlichting poort van de stereomicroscoop.

   Beeldacquisitie en hardware synchronisatie worden gerealiseerd door aangepaste software. De open source software micromanager kan ook worden gebruikt om de optische opstelling en acquisitie controle.

4. Optische beeldvorming

1. Plaats de stereotaxisch frame onder de stereomicroscoop, de craniale raam in het midden van het gezichtsveld (zie Fig. 2A voor een schematische voorstelling van de optische opstelling).
2. Stem de microscoop te richten op de haarvaten. Voorafgaand aan stimulatie onderzoeken (zie beschrijving in 5) een beeld van de lamp is genomen in het kader 560nm (groen) licht (fiber ring), die een goed contrast voor de bloedvaten beeldvorming biedt. Dit beeld wordt gebruikt als een anatomische controle om de stand van de voorbereiding te controleren en is verworven meerdere malen tijdens het experiment.
3. Voor IOS beeldvorming, het gereflecteerde licht intensiteit is opgenomen door de CCD-camera onder 630 + / -10 nm (rood) verlichting. De beelden werden op full frame (geen binning) met 5 frames per seconde, die overeenkomen met een belichtingstijd van ongeveer 150 ms. Vermogen van de lichtbron wordt aangepast aan re ach grijswaarden van ten minste ~ 3000 op de OB gebied, dicht bij de verzadiging van de CCD pixels putten. Daarmee maakt het mogelijk om gebruik te maken van de 12bits dynamiek van de CCD te zwakke intensiteit veranderingen tijdens de activering vast te leggen. Maximum IOS amplitudes te bereiken ~ 1%.
4. Voor FAS imaging fluorescentie is verworven in het kader excitatie van 480Nm + /-20nm (blauw) epiflurorescence licht. Een high-pass filter op 515 Nm is ingesteld om licht te vangen. De beelden werden op 5 frames per seconde met een binning van 4 bij 4 om de gevoeligheid te maximaliseren. Excitatielicht vermogen wordt eveneens aangepast aan de IOS met grijze niveaus van 3000 op de OB-gebied. Maximum FAS amplitudes te bereiken ~ 3%.

   Voor beide beeldvormende modaliteiten, de diepte van het veld in het onderwerp vlak is hetzelfde en werd gemeten op 0,5 mm voor een vergroting van ongeveer 4 keer.

5. Lampje moet worden uitgeschakeld tussen de beeldvorming proeven om te voorkomen dat verwarming en fotobleken van het preparaat.

le "> 5. Imaging studies

1. Standaard beeldvorming sessie omvatte een baseline van 5 tot 10 s waar alleen de lucht is uitgebracht, gevolgd door de geur stimulatie voor 3 tot 10s afhankelijk van de gekozen geur concentratie, en 70 tot en 82s zijn verder opgenomen met een constante luchtstroom voor baseline herstel (Fig. 2A). Aan het einde van de proef, is licht uitgeschakeld en zuivere lucht is geleverd voor de inter trial interval duur (1 tot 3 minuten) uit te spoelen resterende geurmoleculen en zintuiglijke gewenning te vermijden. Geur studies werden doorschoten met blanco trials (luchttoevoer).
2. Geur-opgeroepen geactiveerde zones worden gevisualiseerd als ruwweg bolvormige gebieden op de kaarten en afgestemd op de grootte van de individuele glomeruli (80 tot 200μm in diameter ^9). Beeldverwerking wordt uitgelegd in figuur 2B. Olfactorische kaarten zijn weergegeven in figuur 3. Strijdig zijn met andere sensorische systeem, de signaal-ruis verhouding in de OB was voldoende om geur-geëvoceerde responsen op te lossen in enkele studies (Fig. 3B voor IOS en Fig. 3D voor FAS).
3. Muizen zijn direct geëuthanaseerd aan het einde van de beeldvormende bijeenkomst met behulp van methoden in overeenstemming met de Europese aanbevelingen voor de zorg en het gebruik van proefdieren.

6. Representatieve resultaten (zie de olfactorische kaarten in figuur 3):

Figuur 1 Structurele organisatie van de voornaamste reukorgaan in knaagdieren. Olfactorische sensorische neuronen, primaire zintuigcellen zich in het hoofdgebouw olfactorische epitheel, drukken dezelfde odorant receptor en samenkomen op dezelfde glomeruli in de OB. Olfactorische glomeruli, de ronde neuropils (gestippelde cirkels), bevinden zich aan de oppervlakte van de OB. Merk op dat een zeer dichte en complexe vasculaire netwerk is aanwezig op de glomerulaire niveau. Afkortingen (boven / beneden): ONL: reukzenuw laag; GL: glomerulaire laag, EPL: externe plexiform laag; MCL:mitralisklep cellaag, GCL: granule cell laag.

Figuur 2 reflectie en fluorescentie-signalen opnemen in vivo. A. Wide-field optische beeldvorming setup. De hersenen van een verdoofde muis is blootgesteld aan rood (IOS) of blauw (FAS) licht door ofwel een ringvormige fiber ring bevestigd aan de optiek lens of een epi-verlichting-poort van een microscoop. Geuren worden geladen in verzegelde flesjes en geodoriseerde lucht wordt geleverd aan het dier neus (groen licht: open ventiel). B. Opname protocol en verwerking van gegevens. IOS en FAS worden geboekt als reeks individuele studies (jaren '90 van de duur). Het diagram toont de tijdlijn van een enkele studie: baseline varieert van 5 tot 10s, stimulatie van 3 tot en met 10s, en keer terug naar de uitgangswaarde van 70 tot 82s. Beeldverwerking vereist pixel-voor-pixel aftrekken van de intensiteit waarden tijdens de baseline de intensiteit van de waarden tijdens periodes van stimulatie (voor FAS) or stimulatie plus weer tot de uitgangswaarde (voor IOS). Dit verschil wordt vervolgens gedeeld door baseline waarden om een variatie te krijgen in% (zie de resulterende beelden in Fig. 3).

Figuur 3 Geur opgewekte activiteit van kaarten in de OB met behulp van IOS en FAS beeldvorming. A. vaatstelsel van de dorsale OB zichtbaar onder groen licht. BC. IOS afgebeeld (een onderzoek ten opzichte van drie trials gemiddeld respectievelijk) voor een 10s presentatie van 20% hexanal. Witte pijlen geven de bolvormige regio's van belang geactiveerd door deze geur. Deze activatie kaarten werden verkregen met behulp van de frames gemiddeld tijdens de eerste seconden na het einde van de geur stimulatie (maximaal reflectie variatie -0,63% in A en -0,52% in B). Let op de zwarte zones van absorptie waar de geur activering heeft plaatsgevonden. CD. FAS verworven opeenvolgend in dezelfde muis voor dezelfde geurstof (een onderzoek ten opzichte van drie gemiddeld trials respectievely). Deze activatie kaarten werden verkregen met behulp van de frames gemiddeld tijdens de eerste seconden na het begin van geur stimulatie (maximaal fluorescentie variatie +0.72% in D en +0.66% in E). Merk op dat de witte zones van autofluorescentie emissie aangegeven met zwarte pijlen overeen met de zwarte zones in IOS. De korrelige aspect gezien in de FAS kaart is te wijten aan de 4 bij 4 binning die nodig zijn voor de verbetering van de gevoeligheid. FAS beelden werden niet gecorrigeerd door autofluorescentie bleken. Werkelijke afmetingen van foto's BE: 0,7 mm breed x 1,2 mm lang.

Discussie

In dit artikel geven we IOS en FAS beeldvormingstechnieken voor in vivo-opnames van geur-opgeroepen de activiteiten in de muis OB. Om dit doel te bereiken een relatief eenvoudige en betaalbare wide-field optische beeldvorming setup nodig is. De overname van beeldgegevens vereist training om de fijne chirurgische ingrepen uit te voeren en voorkomen schade aan de dura of hersenweefsel. In het bijzonder zullen grote bloeden te absorberen fotonen opgenomen voor beeldvorming en uiteindelijk het experiment.

Een voordeel van IOS en FAS beeldvorming is om te voorkomen dat de injectie van tl-tracers die zouden kunnen leiden in cellulaire toxiciteit of ongewenste neveneffecten. Ze maken het mogelijk om vragen over olfactorische kaarten dus ruimtelijke codering van zintuiglijke prikkels aan te pakken. In tegenstelling tot twee-deoxyglucose imaging, bieden ze de mogelijkheid om de afbeelding meerdere geuren in een enkel dier. Echter, omdat foton penetratie is beperkt in het weefsel, zijn IOS en FAS beperkt tot het dorsale deel van de OBen kunnen niet worden opgenomen van de ventrale regio's.

Endogene optisch signaal imaging biedt uitstekende ruimtelijke resolutie voor in vivo beeldvorming. Technische verbeteringen betreffen kwantitatieve berekeningen van vasculaire componenten in de reflectie-signalen ^8,9 en dynamiek van bloed-oxygenatie en volume tijdens de zintuiglijke activering ^10. Meerdere golflengten beeldvorming van IOS imaging methoden zijn op dit moment ontwikkeld in ons laboratorium aan de totale hemoglobineconcentratie en zuurstofvoorziening in de OB volledig te kwantificeren tijdens de zintuiglijke activering. Deze spectroscopische optische metingen toegevoegd aan FAS beeldvorming geeft de mogelijkheid om de onopgeloste relatie tussen vasculaire en intracellulaire dynamiek te beantwoorden tijdens de zintuiglijke activering ^11,12.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van The Regent	Vennootschap	Catalogus nummer
Imalgene	Merial
Rompun	Bayer
Agarose, type III-A	Sigma-Aldrich	A9793-50G
Hexanal 98%	Aldrich	115606-100ML