Protocollen voor Vaginale Inenting en Sample Collection in het experimenteel muismodel van Candida Vaginitis

Summary

Belangrijke technieken om te worden gebruikt bij de evaluatie van Candida Vaginitis in een experimenteel diermodel beschreven. De methoden zal een snelle inzameling van vaginale specimens en lymfocyten uit drainerende lumbale lymfeklieren. Deze technieken zou kunnen leiden tot muismodellen van andere ziekten in de vrouwelijke lagere genitale tractus.

Abstract

Vulvovaginale candidiasis (VVC), veroorzaakt door Candida-soorten, is een schimmelinfectie van de lagere vrouwelijke geslachtsorganen dat ongeveer 75% van anders gezonde vrouwen treft tijdens hun reproductieve jaren ^18,32-34. Predisponerende factoren zijn onder meer het gebruik van antibiotica, ongecontroleerde diabetes en verstoring van de voortplanting hormoonspiegels ten gevolge van zwangerschap, orale anticonceptiva of hormoonvervangende therapieën ^33,34. Recurrente VVC (RVVC), gedefinieerd als drie of meer episodes per jaar, van invloed op een aparte 5 tot 8% van de vrouwen met geen predisponerende factoren ^33.

Een experimenteel muismodel van VVC is vastgesteld en gebruikt om de pathogenese en mucosale gastheer reactie op Candida ^{3,4,11,16,17,19,21,25,37} studeren. Dit model is ook gebruikt om potentiële anti-schimmel therapieën te testen in vivo ^13,24. Het model vereist dat de dieren worden gehouden in een staat van pseudoestrus voor optiMAL Candida kolonisatie / infectie ^6,14,23. Onder dergelijke omstandigheden zal geënte dieren hebben aantoonbaar vaginale schimmel last voor weken tot maanden. Verleden studies tonen een extreem hoge parallel tussen het diermodel en menselijke besmetting met betrekking tot immunologische en fysiologische eigenschappen van ^3,16,21. Verschillen zijn echter ook een gebrek aan Candida als normale vaginale flora en een neutrale vaginale pH in de muizen.

Hier tonen we een reeks belangrijke methoden in de muis vaginitis model dat vaginale inenting, een snelle inzameling van vaginale exemplaren, de beoordeling van de vaginale schimmel last, en weefsel de voorbereidingen voor mobiele extractie / isolatie te nemen. Dit wordt gevolgd door representatieve resultaten voor de bestanddelen van vaginale lavage vocht, schimmel last, en de drainerende lymfeklier leukocyten oplevert. Met het gebruik van verdoving, kan lavage monsters worden verzameld op verschillende tijdstippen op dezelfde muizen voor longitudinale evaluatie van deinfectie / kolonisatie. Bovendien is dit model vereist geen immunosuppressieve middelen te initiëren infectie, waardoor immunologische studies onder gedefinieerde omstandigheden gastheer. Ten slotte is het model en elke techniek introduceerde hier zou kunnen leiden tot het gebruik van de methoden om andere besmettelijke ziekten van de lagere vrouwelijke geslachtsorganen (bacteriële, parasitaire, virale) en de respectieve lokale of systemische afweer van de gastheer te onderzoeken te geven.

Protocol

1. Vaginale inoculatie met Candida albicans

1. Drie dagen vóór de inoculatie, terwijl straatverbod het dier naar de buik bloot, injecteren van 100 ul van sesamolie met 0.1-0.5 mg van de β-estradiol subcutaan in de onderbuik. Vooraf de naald ongeveer 5 tot 10 mm lateraal van de huid om lekkage van de injectieplaats te minimaliseren.
   De subcutane toediening van oestrogeen in de onderbuik is optimaal in dit model als gevolg van de nabijheid van de genitale tractus. Effectieve doses kan per muizenstammen, leeftijd of oestrogeen derivaten. In voorgaande studies met CBA-J (H-2 ^κ), C3H/HeN (H-2 ^κ), C57BL / 6 (H-2 ^{onder b),} Balb / c (H-2 ^d), DBA / 2 (H- 2 ^d), SJL (H-2 ^s) muizen op 6-8 weken oud zijn, 0,1 mg/100 pi werd gevonden effectief bewezen door verdikking van de vaginawand, verminderde vaginale slijm enverhoogde epitheliale cellen vervelling. Muizen die werden behandeld met oestrogeen boven bij deze concentratie vertonen consistent vaginale kolonisatie met Candida. Voor de inenting in muizen van andere stammen en leeftijden, is een pilot-studie werd aanbevolen om de effectiviteit van oestrogeen zorgen onder de gewijzigde omstandigheden en de dosis oestrogeen, indien nodig te verhogen.
   Het oestrogeen oplossing moet vers worden bereid elke keer op de dag van de injectie. Om ervoor te zorgen volledige oplosbaarheid van oestrogeen in sesamolie, meng grondig de oplossing met behulp van een vortex mixer en warmte met tussenpozen bij 37 ° C. Herhaal de injectie wekelijks gedurende de hele studieperiode.
2. Ter voorbereiding op het inoculum, voeg een entoog met bacterie C. albicans blastoconidia uit een recente subcultuur voorbereiding op Sabouraud-dextrose agar (SDA) in 10 ml van Phytone-pepton bouillon aangevuld met 0,1% glucose. Incubeer de bouillon cultuur stationaire fase gedurende 18 uur bij 25 ° C in een schuddend waterbad.
3. Na de incubatie, verzamel ee bouillon cultuur in een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 800 xg gedurende 5 minuten. Twee keer was de pellet met steriele PBS.
4. Opsommen levensvatbaar blastoconidia op een hemocytometer door trypan blauwe kleurstof uitsluiting. Pas de cel concentratie tot 2,5 x 10 ⁶ / ml (of om een gewenste inoculum concentratie) in een steriele PBS.
5. Te stabiliseren met de muis, houdt u de basis van de staart met twee vingers en til de heup naar boven, zodat de vaginale opening gezichten naar u toe (figuur 1a). Het is ideaal als de muis wordt geplaatst op een vlakke ondergrond geraspte (bijv. kooi boven), zodat de muis kan weerstand bieden tegen de staart terughoudendheid.
6. Pipetteer 20 ui (of een gewenste volume niet hoger zijn dan 20 ul) van het inoculum opschorting door het inbrengen van de pipetpunt ongeveer 5 mm diep in de vaginale lumen (Figuur 1B). Vul deze stap zo snel en voorzichtig mogelijk te minimaliseren nood in de muis.

2. Vaginale spoelsels

1. Na de euthanasie (of anesthesie), houde met de muis naar beneden door de basis van de staart met twee vingers, zodat de vaginale opening wordt blootgesteld.
2. Lavage de vaginale lumen door de invoering van 100 pi steriel PBS met herhaalde aspiratie en agitatie met een pipet tip. De pipetpunt kan verstopt raken met cellen. Als dit gebeurt, afzien van de belemmerende cellen en verder lavaging met resterende PBS in de vagina. Verzamel de lavage vloeistof in een microcentrifugebuis.
3. Als alternatief kan vaginale spoelsels worden uitgevoerd op verdoofde muizen met isofluraan inhalatieoplossing anesthesie. Voor deze, bloot de muizen aan verdampte isofluraan tot ze volledig verdoofd (~ 30 sec.). Houd de muizen naar beneden door de basis van de staart en voorzichtig lavage de vaginale lumen met behulp van 50 pi steriel PBS. Zorg ervoor dat u hard onrust te vermijden met een pipet tip om trauma te minimaliseren om de vagina tijdens deze procedure. Gesedeerd muizen moeten herstellen van anesthesie binnen 30 sec van de blootstelling aan de omgevingslucht.

   Isofluraankan worden verdampt met behulp van een verdamper isofluraan en O ₂ (bij voorkeur) of een standaard-drop systeem afgesloten kamer zonder verdoving de verdamper systeem (moet nauwlettend worden gevolgd, terwijl het dier verdoofd om ademnood te voorkomen).

   Vaginale spoelsels op verdoofde muizen moet de methode van keuze voor longitudinale lavage monsters op dezelfde muizen worden. Opeenvolgende lavaging heeft geen invloed op de beoordeling van de schimmel belasting na verloop van tijd ^41.

4. Voor nat-mount bereidingen, overdracht 10 ul van de lavage vloeistof op een glasplaatje en let op 400-1000x vergroting met lichtmicroscopie. Daarnaast kunnen cellulaire fracties van de lavage vloeistof gekleurd worden naar cel en nucleaire morfologie onderzoeken. Voor uitstrijkje voorbereiding, overdracht 10 ul van de lavage vloeistof op een glasplaatje en voorzichtig verspreiden met behulp van de buitenwand van een pipet tip. Behoud van het uitstrijkje monsters met CytoPrep fixatief en vlekken door de standaard Papanicolaou techniek (uitstrijkje). Let op bij 400 × vergroting met lichtmicroscopie.

3. Kwantificering van vaginale schimmel last

1. In een 96 well-ronde bodemplaat, de overdracht van de lavage vloeistof in een goed van de bovenste rij en 180 ul van steriele PBS in de volgende vijf bronnen van die kolom (beneden de plaat).
2. Maak 01:10 seriële verdunningen van vaginaal vocht lavage door de overdracht van de 20 ul van de vloeistof naar het volgende goed in de kolom. Meng goed door herhaalde aspiratie voor elke overdracht. Seriële verdunningen van maximaal 12 lavage (een volledige horizontale rij) kan gelijktijdig worden uitgevoerd met behulp van een 12-kanaals pipet.
3. Te beginnen met de laagste verdunning, overdracht 10 ul van het monster op Sabouraud-dextrose agar (SDA). Plating van maximaal 36 monsters kunnen worden uitgevoerd op een plaat met behulp van SDA opgesteld in vierkante petrischaaltjes met rooster en een instelbare afstand multichannel pipet.
4. Opsommen kolonievormende eenheden (CFU's) na incubatie bij 34 ° C fof 48 h.

4. Vaginale weefsel extractie

1. Na de vaginale spoeling procedure, leg het inslapen muis op zijn rug en verzadigen de liesstreek met 70% ethanol. Met behulp van een pincet, de hoorn van de urine-opening naar boven, zodat de vaginale opening wordt blootgesteld.
2. Plaats een paar gebogen pincet in de vaginale lumen en zoek de baarmoederhals. Met behoud van een stevige grip met de tang, extract van de baarmoederhals door de vaginale holte (Figuur 2A-C).
3. Accijnzen de vagina aan de voet van de vaginale opening en verwijder vervolgens de baarmoederhals van de vagina met chirurgische schaar. Houd in gedachten dat het vaginale weefsel geïnvolueerd is (innerlijke epitheel-kant van de vagina naar buiten blootgesteld). Het weefsel kan zijdelings of worden omgekeerd om de oorspronkelijke oriëntatie van de vagina te behouden of geopend in een blad door het maken van een laterale incisie.

   Weggesneden vaginale weefsel kan gebruikt worden voor 1) lymfocyten extractie volgende collagenase spijsvertering (~ 1 × 10 ⁴ / muis) ^40, 2) epitheliale celisolatie volgende dispase spijsvertering (~ 5 × 10 ⁴ / muis) ^28, 3) bevroren of paraffine-ingebed voorbereidingen voor de histologische analyses ^25.

5. Lumbale lymfeklieren excisie

1. Na de vaginale spoeling procedure, leg het inslapen muis op zijn rug en verzadigen de buik met 70% ethanol. Maak een laterale incisie vanaf de onderbuik naar de borst en bloot de inwendige organen. Met behulp van een pincet in beide handen, zet de darmen omhoog, zodat de centrale bloedvaten zichtbaar worden.
2. Zoek de vena cava inferior en abdominale aorta. Normaal gesproken kan een paar van de lumbale lymfeklieren worden geïdentificeerd naast de abdominale aorta, ligt ongeveer halverwege tussen de oorsprong van de nier en de gemeenschappelijke iliacale slagaders ^39. Deze lymfeklieren kunnen visueel worden onderscheiden van het vetweefsel door de elastische textuuren zijn lichter en meer ondoorzichtige in kleur ten opzichte van vetweefsel (figuur 3). Deze lymfeklieren zijn aanzienlijk groter bij besmette dieren in vergelijking met niet-geënte dieren.
3. Accijnzen de lymfeklieren door het plaatsen van microforceps onder het knooppunt en dan trek maximaal te scheiden van het omringende weefsel.

6. Isolatie van lymfoïde cellen in single-cell suspensies

1. Transfer lymfeklieren op een steriel gaas scherm (ongeveer 3 x 3 cm ² groot) geplaatst in een steriele glazen petrischaal met ~ 10 ml van gebalanceerde zoutoplossing Hanks "(HBSS) (figuur 4).
2. Met de petrischaal enigszins schuin, drukt u op de lymfeklieren tegen het scherm met een spuit zuiger kop. Zorg ervoor dat alle lymfeklieren te breken, zodat de cellulaire inhoud van de knooppunten passeren op het scherm terwijl de niet-cellulaire componenten van de knooppunten (dat wil zeggen, membranen, stroma, vet) blijven op het scherm.
3. Met dezelfde zuiger en spuit, zuigen thij HBSS met cellen. Was het scherm met ~ 5 ml HBSS en het verzamelen van de resterende vloeistof in een 15 ml conische buis.
4. Centrifugeer bij 800 xg gedurende 10 minuten. Aspireren eventuele vetafzetting op de top van de vloeistof met een pipet voor het teruggooien van het vocht. Was de celpellet drie keer met HBSS. Resuspendeer de pellet in 1 ml HBSS en sommen levensvatbare cellen door trypan blauwe kleurstof uitsluiting.

7. Representatieve resultaten:

De cellulaire fracties van vaginale lavage vloeistof uit> 4-daagse entte muizen in het algemeen bestaan ​​uit Candida, epitheliale cellen en cellulaire infiltraten (figuur 5). Door natte-mount microscopie, kan Candida visueel worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van hyfen als gist (figuur 5A). Smeer de voorbereidingen van vaginale lavage vloeistof kan worden gekleurd door de Papanicolaou-techniek om epitheliale cellen en infiltreren leukocyten, waarvan de belangrijkste cellen neutrofielen geïdentificeerd door de tri-nucle onderzoekenAR kwabben (figuur 5B). Heel weinig neutrofielen, indien van toepassing, zijn gedetecteerd in niet-geënte muizen (figuur 5C) ^41.

Een voorbeeld van een vaginale schimmel belasting is weergegeven in figuur 6. Vaginaal lavage vloeistof verzameld op specifieke tijdstippen worden gekweekt voor de CFU opsomming (figuur 6A). Vaginale kolonisatie / infectie met Candida blijft wekenlang in de oestrogeen-behandelde muizen ingeënt (figuur 6B), terwijl Candida niet aan vaginale kolonisatie vestigen in niet-oestrogeen-behandelde muizen ingeënt (Figuur 6C). Oestrogeen-behandelde muizen niet-geënte blijft negatief voor Candida in de tijd (gegevens niet getoond). Daarnaast kunnen vaginale spoelsels te worden uitgevoerd hetzij een keer op een aparte muizen op elk tijdstip of overlangs in dezelfde muizen onder narcose.

De lumbale lymfeklieren zijn de primaire drainerende lymfeknopen van de voortplantingsorganen en de meest relevante website te evalueren voor systemische immuunrespons op een vaginale uitdaging. NOTE dat deze lymfeklieren kunnen worden uitgebreid in entte muizen in, terwijl deze normaliter voorkomen erg klein in niet-geënte muizen. Leukocyten cellulaire terugvorderingen doorgaans variëren van 8 × 10 ⁵ / niet-geënte muis om 5 × 10 ⁶ / ingeënt muis. Naast de lumbale lymfeklieren, kan lies, knieholte en mesenteriale lymfeklieren ook worden gebruikt.

Figuur 1. Vaginale inoculatie met Candida. A) Een muis ingehouden voor de inenting. De muis is geplaatst op een kooi plaatsen en gehouden door de basis van de staart, iets omhoog om de benen te tillen en de vaginale opening bloot te leggen. De heup van de muis kan worden gestabiliseerd met dezelfde hand als het probeert te verzetten tegen de staart terughoudendheid. B) Invoering van het inoculum in de vaginale lumen. Een pipet tip is zachtjes geplaatst ongeveer 5 mm diep in de vaginale lumen. De suspensie inoculum wordt dan afgezet.

Figuur 2. Vaginale weefsel extractie. AB) Extractie van de baarmoederhals. De baarmoederhals ligt met gebogen pincet en naar buiten worden blootgesteld door de vaginale holte. Eenmaal uit de vaginale holte, wordt de baarmoederhals verder getrokken naar buiten om volledig bloot te leggen van de vagina. C) Extractie van de vagina. De vagina is uitgesneden uit de vulva met een schaar. Eenmaal los, verwijder de baarmoederhals uit de vagina.

Figuur 3. Identificatie van de lumbale lymfeklieren. De locatie van de lumbale lymfeklieren onder de omliggende organen / bloedvaten in de nabijheid van het bekken wordt aangegeven. Een, abdominale aorta. B, de blaas. C, gemeenschappelijke iliacale slagader. Ik, darmen. L, lever. R, rectum. S, de milt. U, baarmoeders.

Figuur 4. De lumbale lymfeklieren geplaatst op een gaas-scherm. De lymfeklieren worden samengevoegd op het scherm geplaatst in een petrischaal met HBSS. De lymfeklieren zijn gedrukt tegen het scherm met een zuiger van de spuit om lymfoïde cellen te verkrijgen in single-cell suspensies.

Figuur 5. Cellulaire fracties van vaginale lavage vocht uit geïnoculeerde muizen. A) Wet-mount en B) uitstrijkje voorbereidingen van vaginale lavage monsters verzameld vier dagen na de inenting en C) van de niet-geënte muizen. Beelden worden getoond op 1000 × (A) of 400 × (B, C) vergroting. De insert in B toont de nucleaire morfologie van vaginale neutrofielen bij 1000 ×. Candida gist (Y) en hyphae (H), epitheelcellen (EC) en neutrohils (N) zijn aangegeven.

Figuur 6. Detection van vaginale schimmel last. A) Representatieve C. albicans kolonies gegroeid op een SDA plaat. Nette (N) lavage monsters van zes verschillende entte muizen in (bovenste rij) werden serieel verdund en gekweekt CFU opsomming. B) Kwantificering van de vaginale schimmel lasten in oestrogeen-behandeld en C) niet-oestrogeen-behandelde muizen. Kve/100 pi lavage vloeistof uit entte muizen werd beoordeeld op aangegeven tijdstippen.

Discussion

Een experimenteel muismodel van Candida vaginitis is vastgesteld en historisch gebruikt voor de afgelopen decennia mucosale gastheer reactie op Candida studie en voor het testen van antischimmel therapieën ^{3,4,11,13,16,17,19,21,24, 25,37.} De protocollen die hier nemen efficiënte en minder arbeidsintensieve methoden, en lijken een van de meest optimale model systemen van Candida vaginitis beschreven. Deze technieken maken een snelle kwantificering van de schimmel last en het verzamel...

Materials

Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties
Vrouwelijke CBA / J muizen	Charles River Laboratories	01C38	5-6 weken oud
Candida albicans (3153A)	Nationale collectie van schimmels, Verenigd Koninkrijk	NCPF3153
Sesamolie	Sigma-Aldrich	S3547	Hoeft niet te worden vooraf gesteriliseerd voor gebruik
Β-estradiol 17-valeraat	Sigma-Aldrich	E1631	0.1-0,5 mg in sesamolie
Phytone pepton	Becton Dickinson	211906	Aan te vullen met 0,1% glucose
Trypan blauwe oplossing	Sigma-Aldrich	T8154
Sabouraud dextrose agar	Becton Dickinson	211584
Collagenase type IV	Sigma-Aldrich	C5138	0,25%
Dispase	Invitrogen	17105-041	1.7 U / ml
Gaas schermen	TWP	060X060S0065W36T	No 60 mesh, roestvrij
Gebalanceerde zout Hanks 'oplossing	Invitrogen	24020-117
CytoPrep fixatief	Fisher Scientific	12-570-10	Behoudt uitstrijkje dia's
Papanicolaou vlek EA-65	Merck Chemicals	7054X-85
Papanicolaou vlek OG-6	Merck Chemicals	7052X-85
Harris 'Alum hematoxyline	Merck Chemicals	638A-85
Isofluraan	Baxter Healthcare	NDC 10019-773-60	Gebruikt met isofluraan verdamper of in een daling van het systeem gesloten verdoving kamer