High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten Met behulp van de lipidische Bicelle Method

Summary

Bicelles zijn lipide / amfifiele mengsels die membraaneiwitten (MP's) te behouden binnen een lipide bilaag, maar hebben een unieke fase gedrag dat high-throughput screening vergemakkelijkt door kristallisatie robots. Deze techniek heeft met succes geproduceerd een aantal hoge resolutie structuren van zowel prokaryotische en eukaryotische bronnen. Deze video beschrijft protocollen voor het genereren van de lipidische bicelle mengsel, waarin parlementsleden in de bicelle mengsel, het opzetten van kristallisaties trials (zowel handmatig als robot) en het oogsten van kristallen van het medium.

Abstract

Membraaneiwitten (MP's) spelen een cruciale rol in vele fysiologische processen, zoals het verpompen van specifieke moleculen door de anders ondoordringbare membraan bilaag dat alle cellen en organellen omringt. Wijzigingen in de functie van de parlementsleden resulteren in een groot aantal menselijke ziekten en aandoeningen, dus een ingewikkeld begrip van hun structuren blijft een kritische doelstelling voor biologisch onderzoek. Echter, de structuur bepaling van de parlementsleden blijft een belangrijke uitdaging vaak in het kader van hun hydrofobiciteit.

Kamerleden hebben grote hydrofobe regio's ingebed in de bilaag. Wasmiddelen worden vaak gebruikt om deze eiwitten solubiliseren van de bilaag het genereren van een eiwit-detergent micel die vervolgens kan worden gemanipuleerd op een soortgelijke wijze als oplosbare eiwitten. Traditioneel, kristallisatie onderzoeken gaat met behulp van een eiwit-detergent mengsel, maar ze vaak tegen kristallisatie of produceren kristallen van slechte kwaliteit. Deze problemen ontstaan ​​door dereinigingsmiddel niet in staat is adequaat te bootsen de bilaag resulteert in een slechte stabiliteit en heterogeniteit. Daarnaast, het wasmiddel schilden het hydrofobe oppervlak van de MP het verminderen van de beschikbare oppervlakte voor de kristallen contacten. Om deze nadelen te omzeilen Kamerleden kunnen worden gekristalliseerd in lipide media, die nauwer simuleert hun endogene omgeving, en is sinds kort een de novo techniek voor MP kristallisatie.

Lipidische kubieke fase (LCP) is een drie-dimensionale lipide bilaag doorboord door een stelsel van systemen van waterige kanalen ^1. Hoewel monoolein is de lipide van keuze, hebben verwante lipiden, zoals monopalmitolein en monovaccenin ook gebruikt om de LCP ² te maken. Kamerleden zijn opgenomen in de LCP, waar ze verspreiden in drie dimensies en diervoeders kristal kernen. Een groot voordeel van de LCP is dat het eiwit blijft in een meer eigen omgeving, maar de methode heeft een aantal technische nadelen zoals hoge viscositeitosity (die gespecialiseerde apparaten), en de moeilijkheden in kristal visualisatie en manipulatie ^3,4. Door deze technische problemen, gebruikten we een ander lipide medium voor kristallisatie-bicelles ^5,6 (figuur 1). Bicelles zijn lipide / amfifiele mengsels gevormd door het mengen van een phosphatidylcholine lipide (DMPC) met een amfifiel (CHAPSO) of een korte keten lipide (DHPC). Binnen elke bicelle schijf, de lipide moleculen genereren een bilaag, terwijl de amfifiele moleculen langs de randen van het verstrekken van apolaire gunstige eigenschappen van zowel de dubbellagen en detergenten. Belangrijk is dat beneden hun overgang temperatuur, eiwit-bicelle mengsels hebben een gereduceerde viscositeit en worden gemanipuleerd op een soortgelijke wijze als detergent-oplosbaar parlementsleden, waardoor bicelles compatibel met kristallisatie robots.

Bicelles zijn met succes gebruikt te kristalliseren verschillende membraaneiwitten ^5,7-11 (tabel 1). Deze groeiende collectievan eiwitten toont de veelzijdigheid van bicelles voor kristalliseren zowel alfa helix en beta-sheet parlementsleden van prokaryote en eukaryote bronnen. Vanwege deze successen en de eenvoud van high-throughput implementatie, moet bicelles deel uitmaken van arsenaal van elke membraaneiwit kristallograaf's. In deze video beschrijven we de bicelle methodologie en bieden een stap-voor-stap protocol voor het opzetten van high-throughput kristallisatie proeven van gezuiverd Kamerleden met behulp van standaard robotica.

Protocol

Bicelle op basis van kristallisatie bestaat uit vier basisstappen (figuur 2): i) de voorbereiding van een bicelle vorming van lipiden: amfifiele mengsel; ii) de bijmenging van gezuiverde eiwit in de bicelle medium; iii) kristallisatie onderzoeken (handmatig of robot), en iv) visualisatie, kristal extractie en bevriezing. Deze stappen worden hieronder in detail beschreven

1. Voorbereiding van de Bicelles

Bicelles kunnen vormen in een verscheidenheid van lipide: amfifiele combinaties en over een breed scala aan concentraties. Daarom is voorwaarden-een eerste compositie-op basis van eerdere succesvolle aanbevolen <....

Discussion

Bicelles zijn een unieke lipidische media die een native bilaag-achtige omgeving te bieden terwijl ze zelf als oplosbaar gemaakt door detergenten. Deze eigenschap geeft bicelles een duidelijk voordeel ten opzichte van andere lipide-gebaseerde methoden kristallisatie aangezien er geen leercurve of gespecialiseerde apparatuur die nodig is voor deze techniek. Zodra bicelles beschikbaar zijn, zowel commercieel of bereid in het laboratorium, kunnen ze direct worden gemengd met gezuiverd eiwit en vanaf dit moment kristallisat.......