High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten Met behulp van de lipidische Bicelle Method

Summary

Bicelles zijn lipide / amfifiele mengsels die membraaneiwitten (MP's) te behouden binnen een lipide bilaag, maar hebben een unieke fase gedrag dat high-throughput screening vergemakkelijkt door kristallisatie robots. Deze techniek heeft met succes geproduceerd een aantal hoge resolutie structuren van zowel prokaryotische en eukaryotische bronnen. Deze video beschrijft protocollen voor het genereren van de lipidische bicelle mengsel, waarin parlementsleden in de bicelle mengsel, het opzetten van kristallisaties trials (zowel handmatig als robot) en het oogsten van kristallen van het medium.

Abstract

Membraaneiwitten (MP's) spelen een cruciale rol in vele fysiologische processen, zoals het verpompen van specifieke moleculen door de anders ondoordringbare membraan bilaag dat alle cellen en organellen omringt. Wijzigingen in de functie van de parlementsleden resulteren in een groot aantal menselijke ziekten en aandoeningen, dus een ingewikkeld begrip van hun structuren blijft een kritische doelstelling voor biologisch onderzoek. Echter, de structuur bepaling van de parlementsleden blijft een belangrijke uitdaging vaak in het kader van hun hydrofobiciteit.

Kamerleden hebben grote hydrofobe regio's ingebed in de bilaag. Wasmiddelen worden vaak gebruikt om deze eiwitten solubiliseren van de bilaag het genereren van een eiwit-detergent micel die vervolgens kan worden gemanipuleerd op een soortgelijke wijze als oplosbare eiwitten. Traditioneel, kristallisatie onderzoeken gaat met behulp van een eiwit-detergent mengsel, maar ze vaak tegen kristallisatie of produceren kristallen van slechte kwaliteit. Deze problemen ontstaan ​​door dereinigingsmiddel niet in staat is adequaat te bootsen de bilaag resulteert in een slechte stabiliteit en heterogeniteit. Daarnaast, het wasmiddel schilden het hydrofobe oppervlak van de MP het verminderen van de beschikbare oppervlakte voor de kristallen contacten. Om deze nadelen te omzeilen Kamerleden kunnen worden gekristalliseerd in lipide media, die nauwer simuleert hun endogene omgeving, en is sinds kort een de novo techniek voor MP kristallisatie.

Lipidische kubieke fase (LCP) is een drie-dimensionale lipide bilaag doorboord door een stelsel van systemen van waterige kanalen ^1. Hoewel monoolein is de lipide van keuze, hebben verwante lipiden, zoals monopalmitolein en monovaccenin ook gebruikt om de LCP ² te maken. Kamerleden zijn opgenomen in de LCP, waar ze verspreiden in drie dimensies en diervoeders kristal kernen. Een groot voordeel van de LCP is dat het eiwit blijft in een meer eigen omgeving, maar de methode heeft een aantal technische nadelen zoals hoge viscositeitosity (die gespecialiseerde apparaten), en de moeilijkheden in kristal visualisatie en manipulatie ^3,4. Door deze technische problemen, gebruikten we een ander lipide medium voor kristallisatie-bicelles ^5,6 (figuur 1). Bicelles zijn lipide / amfifiele mengsels gevormd door het mengen van een phosphatidylcholine lipide (DMPC) met een amfifiel (CHAPSO) of een korte keten lipide (DHPC). Binnen elke bicelle schijf, de lipide moleculen genereren een bilaag, terwijl de amfifiele moleculen langs de randen van het verstrekken van apolaire gunstige eigenschappen van zowel de dubbellagen en detergenten. Belangrijk is dat beneden hun overgang temperatuur, eiwit-bicelle mengsels hebben een gereduceerde viscositeit en worden gemanipuleerd op een soortgelijke wijze als detergent-oplosbaar parlementsleden, waardoor bicelles compatibel met kristallisatie robots.

Bicelles zijn met succes gebruikt te kristalliseren verschillende membraaneiwitten ^5,7-11 (tabel 1). Deze groeiende collectievan eiwitten toont de veelzijdigheid van bicelles voor kristalliseren zowel alfa helix en beta-sheet parlementsleden van prokaryote en eukaryote bronnen. Vanwege deze successen en de eenvoud van high-throughput implementatie, moet bicelles deel uitmaken van arsenaal van elke membraaneiwit kristallograaf's. In deze video beschrijven we de bicelle methodologie en bieden een stap-voor-stap protocol voor het opzetten van high-throughput kristallisatie proeven van gezuiverd Kamerleden met behulp van standaard robotica.

Protocol

Bicelle op basis van kristallisatie bestaat uit vier basisstappen (figuur 2): i) de voorbereiding van een bicelle vorming van lipiden: amfifiele mengsel; ii) de bijmenging van gezuiverde eiwit in de bicelle medium; iii) kristallisatie onderzoeken (handmatig of robot), en iv) visualisatie, kristal extractie en bevriezing. Deze stappen worden hieronder in detail beschreven

1. Voorbereiding van de Bicelles

Bicelles kunnen vormen in een verscheidenheid van lipide: amfifiele combinaties en over een breed scala aan concentraties. Daarom is voorwaarden-een eerste compositie-op basis van eerdere succesvolle aanbevolen (tabel 1). De meest succesvolle mengsel is de DMPC: CHAPSO bicelle formulering, die zowel commercieel kan worden gekocht als een voorgemengde kant-en-klare formulering (zie tabel van reagentia hieronder) of bereid in het laboratorium zoals beschreven. Voor deze oefening zullen we voor te bereiden 1 ml 35% DMPC: CHAPSO mengsel bij een 2.8:1 molaire verhouding.

1. Weeg 0,26 g DMPC (de heer 677,9 g / mol), 0,09 g CHAPSO (de heer 630,9 g / mol) en gedeïoniseerd water tot een eindvolume van 1,0 ml toe te voegen.
   • De bicelle percentage kan variëren tussen 10% -40% met een DMPC: CHAPSO molaire verhouding van 2.6-3.0:1 (tabel 1).
   • Opmerking: Hoe hoger de concentratie bicelle hoe moeilijker het is om ontbinding van de lipide resulteert in een hogere viscositeit van de oplossing. Kan echter een geconcentreerde bicelle formulering voordelig zijn wanneer het eiwit concentratie laag is.
2. Het oplossen van het lipide om een ​​homogene oplossing te verkrijgen vereist een aanzienlijke inspanning, waardoor deze stap wordt het meest tijdrovende in de bicelle methode. Doorloop de volgende stappen totdat het DMPC is volledig gemengd:
   1. Warm het mengsel tot ~ 40 ° C met behulp van een waterbad of een incubator en vortex voor ~ 1 minuut.
      • Opmerking: Zoals meer cycli worden uitgevoerd, zal opwarming van het mengsel resulteert in een gel-achtige conconsistentie waardoor het moeilijk te vortex.
   2. Cool het mengsel op ijs en vortex voor een paar minuten. Koeling helpt vloeibaar te maken van de oplossing waardoor het makkelijker te vortex.
      • Opmerking: Zoals meer cycli worden uitgevoerd, kan het mengsel troebel is geworden na het afkoelen.
   3. Herhaal bovenstaande stappen (1.2.1 en 1.2.2) tot de lipide volledig is opgelost.
      • Opmerking: Dit proces kan enkele uren duren. Bicelle formatie wordt aangegeven door de veranderingen in het fasegedrag van de DMPC: CHAPSO formulering. Na voltooiing zal het mengsel een heldere gel op of boven kamertemperatuur en een stroperige vloeistof op het ijs.
3. De bicelle mengsel is nu klaar voor gebruik en kan worden bewaard bij -20 ° C voor lange-termijn opslag (tot 5 jaar). Vanwege het risico van hydrolyse van de fosfolipide hoofd groep is het niet raadzaam om bicelles op te slaan op kamertemperatuur gedurende langere tijd.

2. Integratie van eiwitten in bicelles

De meeste MP structuren verkregen uit bicelles werden gekristalliseerd in DMPC: CHAPSO bicelle concentratie variërend van 2 tot 8% met behulp van een eiwit concentratie van 8 tot 12 mg / ml (tabel 1). Indien mogelijk dient de eerste schermen gebruik maken van deze richtlijnen en extra concentraties kunnen worden vertoond op de optimalisatie fase. Vergeleken met de LCP-methode, eiwit opname met bicelles is een eenvoudig proces (figuur 3), die moet dezelfde dag worden gedaan als kristallisatie onderzoeken.

1. Ontdooi de DMPC: CHAPSO bicelle mengsel bij kamertemperatuur totdat de fase verandert in een heldere gel.
   • Let op: Meerdere vries-dooi heeft geen invloed op bicelle gedrag.
2. Leg het mengsel op ijs naar vloeibaar en kort vortex tot een homogene bicelle fase te herstellen. Bij plaatsing op ijs kan het mengsel troebel wordt.
3. FrOM dit punt, houden de bicelle mengsel en gezuiverd eiwit op ijs. Dit zorgt ervoor dat de bicelle in een vloeibare fase waardoor het vatbaar is voor pipetteren.
4. Voeg het mengsel aan bicelle het gezuiverde detergent-oplosbaar eiwit in een 1:4 (v / v) verhouding.
   • Bijvoorbeeld: 100 pi eiwit-bicelle mengsel is verkregen door het mengen van 80 ul eiwit met 20 ul bicelle. Als het eiwit concentratie is 15 mg / ml en de bicelle concentratie is 35%, zal dit een bicelle-opgenomen eiwitmengsel geven met een eiwit concentratie van 12 mg / ml en een bicelle concentratie van 7%.
5. Meng door zachtjes pipetteren van de inhoud op en neer totdat de oplossing helder en homogeen is.
   • Opmerking: Als bellen verschijnen, snel een rondje (30-60 seconden, 13000 rpm, 4 ° C) met een tafelblad centrifuge kan helpen verwijderen.
6. Incubeer dit mengsel op ijs gedurende minstens 30 minuten in beslag opname van eiwit int bevordereno bicelles. Het eiwit-bicelle mengsel is nu klaar voor kristallisatie onderzoeken.

3. Het opzetten van kristallisatie onderzoeken

Andere lipiden kristallisatie technieken zoals de LCP vereisen gespecialiseerde apparatuur door de hoge viscositeit van het medium, maar de unieke fasegedrag van bicelles vergunningen implementatie in vrijwel alle standaard kristallisatie formaat inclusief robotica (figuur 3). Kristallisatie onderzoeken kunnen worden uitgevoerd zowel in opknoping of zittend laten vallen formats met behulp van standaard in de handel verkrijgbare schermen.

1. Of het opzetten van trays handmatig of met behulp van een kristallisatie-robot, onderhouden van de eiwit-bicelle mengsel op ijs. Dit zorgt ervoor dat het eiwit-bicelle mengsel koud en ervoor te zorgen dat de viscositeit van de oplossing minimaal is.
2. Handmatige Kristallisatie Trials - Het gebruik van een standaard pipet, kan het eiwit-bicelle mengsel worden gemengd met reservoir oplossing op dezelfde manier als normaal uit te voerened voor oplosbare of een wasmiddel-gesolubiliseerde membraaneiwitten.
   • Opmerking: Bewaar het eiwit-bicelle mengsel op ijs tijdens de trials.
3. Robotic Kristallisatie Trials - We hebben op maat van deze trials voor de Mosquito kristallisatie robot, maar in principe (volgens dezelfde voorzorgsmaatregelen) de techniek moet compatibel zijn met alle kristallisatie robots. De volgende tips zorgen ervoor dat het eiwit-bicelle mengsel afkoelen blijft en nauwkeurig gepipetteerd door de robot:
   1. Precool de plaat die de eiwit-bicelle mengsel door het op ijs.
   2. Pipetteer de eiwit-bicelle mengsel in de plaat en blijven de plaat te houden op het ijs. Deze plaat moet het laatste item om op de robot gaan voor aanvang van de termijn.
   3. Set-up het reservoir lade en kristallisatie deksels op het platform van 3 en 5, van de mug robot.
   4. Plaats de plaat met een eiwit-bicelle mengsel op perron 4van de mug robot. Dit verzekert de eiwit-bicelle mengsel is de laatste om opgehaald te worden door de robot en het is meteen vrijgelaten.
   5. Om te voorkomen dat verwarming en verhoogde viscositeit, moet het reservoir niet mengen met het eiwit-bicelle mengsel.
   6. Bij het uitvoeren van meerdere schermen, direct terug het bicelle-eiwit plaat ijs voor de koeling, zodra een run is voltooid.
4. Drop volume en de ratio (eiwit: reservoir) kan worden gekozen als voor conventionele kristallisatie onderzoeken. Bijvoorbeeld, kan in eerste instantie kristal onderzoeken het gebruik van de Mosquito robot worden ingesteld met behulp van 0,25 ul eiwit: bicelle mengsel plus 0,25 ul reservoir.
5. Incubeer het kristal proeven in een kamer bij 20 ° C. Temperatuur is een goede screening en optimalisatie parameter omdat het fasegedrag van bicelles is afhankelijk van de temperatuur.
   • Hogere temperaturen veroorzaken de lamellaire fase ¹² (figuur 1), die het voordeel van de pre-organisatie heefthet eiwit in lagen. Temperaturen onder 20 ° C kan worden gescreend, maar je moet niet gaan onder 4 ° C sinds dit kan de lipiden veroorzaken neerslag gedurende langere perioden van tijd.
6. Op dezelfde wijze als traditionele kristallisatie onderzoeken, moet bicelle proeven worden gecontroleerd op een regelmatige basis voor kristal uitstraling en groei. Wij raden u aan trays controleren op de 1 ^e en 3 ^e dag post-setup gevolgd door wekelijkse inspectie.
7. Crystal-optimalisatie kan worden uitgevoerd met behulp van methoden routinematig gebruikt voor reinigingsmiddel op basis van kristallen inclusief rooster screening, additief screening, wisselende temperaturen etc. Daarnaast bicelle percentage en eiwit: bicelle-verhouding kan worden gevarieerd. Bovendien kan bicelles worden gedoteerd met specifieke lipiden die nodig kunnen zijn voor eiwit stabiliteit of functie.

4. Visualisatie, kristal extractie en invriezen

Omdat kristallen proeven met het eiwit-bicelle mengsel hebben een viscositeit gelijk aan eiwit-detergent drops, visualisatie en kristal extractie routine is en wordt uitgevoerd zoals de traditionele set-ups.

1. Visualisatie: In tegenstelling tot LCP media die vaak van hoge kwaliteit verlichting vereist onder normale en gepolariseerd licht voor kristal detectie, visualisatie wordt niet gehinderd door bicelles. Gekleurde en kleurloze proteïne kristal druppels kunnen gemakkelijk worden geanalyseerd met behulp van standaard-microscopen en geen speciale apparatuur nodig.
2. Bicelles, net als andere lipide media, hebben de neiging om een ​​hoog percentage valse positieven te produceren. Een UV-microscoop helpt enorm in het onderscheiden van eiwitten uit zoutkristallen (figuur 4).
3. Extractie en Invriezen: Crystal extractie en vriezen is betrekkelijk eenvoudig en vereist geen ontbinding van de omliggende bicelle media. Daarnaast is de bicelle fase zelf biedt een aantal matige cryo-bescherming.

5. Representatieve resultaten:

nt "> Het duurt meestal 2-3 dagen voor de kristallen om te verschijnen en ongeveer een week of meer voor hen om te groeien naar hun maximale grootte. Dit was het geval voor bacteriorhodopsin en muis voltage-afhankelijke anion kanaal 1 (mVDAC1) kristallen ^4,8 . Voor andere membraaneiwitten kan het enkele weken duren voor de kristalgroei, dus het is belangrijk om te blijven monitoren van de kristallen proeven veel verder dan de eerste weken.

Net als bij andere lipide media, bicelles hebben de neiging om vormen die kunnen blijken te zijn kristallijne vorm. Het is ook waargenomen dat ze leiden tot een hoger percentage van zout en afwasmiddel kristallen. Een UV-fluorescentie microscoop die tryptofaan detecteert aanzienlijk kan helpen elimineren dergelijke niet-eiwitachtige false positives. Figuur 4 toont lipide vormen, zout en eiwitkristallen zoals weergegeven in zichtbaar en UV-licht om te helpen de verschillende resultaten die kunnen worden waargenomen onderscheiden.

83fig1.jpg "/>
Figuur 1. Bicelle Schematische. Bicelles zijn samengesteld uit een bilaag vormen van lipide molecuul zoals DMPC (blauw) en een amfifiele, zoals CHAPSO (groen), die de hydrofobe randen van de bilaag beschermt. Naarmate de temperatuur wordt verhoogd, disc-achtige bicelles ondergaan een fase transformatie tot een geperforeerde plaat lamellaire ^12.

Figuur 2. Stroomdiagram voor de bicelle kristallisatie-methode waarin de vier basisstappen.

Figuur 3. Kristal studies set-up schema. Gezuiverd detergent-oplosbaar membraan eiwitten kunnen direct worden gemengd met bicelles op het ijs door simpelweg pipetteren van de inhoud samen. Na het incuberen van de eiwit / bicelle mengsel op ijs voor ~ 30 minuten, kristallisatie onderzoekenkan worden ingesteld met behulp van een standaard-formaat inclusief robotica.

Figuur 4. Visualisatie van kristal proeven. Zichtbare beeld (bovenste paneel) en UV-beeld (onderste paneel) van (A) naaldvormige kristallen waargenomen in een zout-enige voorwaarde. Geen fluorescentie gedetecteerd kan worden van de kristallen, een indicatie van vals-positieve. (B) staafvormige kristallen gevormd in een MPD staat. Het kristal fluoresced zwak, maar bleek te zijn niet-eiwitachtige met behulp van röntgendiffractie. (C) Crystal waargenomen ongeveer vier weken na het opzetten van studies. De sterke fluorescentie onder UV-licht bevestigt het is een eiwit kristal.

Nee.	Eiwit	Bron	Bicelle Formulering	Eiwit Concentratiop	Wasmiddel 1	Resolutie (Å)	Referentie
1	Bacteriorhodopsin 2	Halobacterium salinarum	8% DMPC: CHAPSO (2.8:1)	8 mg / ml		2.0	Faham en Bowie, 2002
			8% DTPC: CHAPSO (03:01)	8 mg / ml		1.8	Faham et al.., 2005
2	β2-adrenerge receptor / Fab complex	Homo sapiens	8,3% DMPC: CHAPSO (03:01)	10 mg / ml	DDM	3.4/3.7	Rasmussen et al.., 2007
3	Voltage-afhankelijke anionen kanaal 1	Mus musculus	7% DMPC: CHAPSO (2.8:1)	12 mg / ml	LDAO	2.3	Ujwal et al.., 2008
4	Xanthorhodopsin	Salinibacter ruber	4,2% DMPC, 5% NM	4 mg / ml	DDM	1.9	Luecke et al.., 2009
5	Parallellogram protease	Escherichia coli	2% DMPC: CHAPSO (2.6:1)	9 mg / ml	Nonyl glucoside	1.7	Vinothkumar, 2011

1 Wasmiddel gebruikt voor membraaneiwit zuivering
2 Inheemse lipiden van paars membranen kunnen worden meegenomen tijdens de zuivering

Tabel 1. Samenvatting van de kristallisatie voorwaarden voor het membraan eiwit structuren opgelost met behulp van bicelles.

Discussion

Bicelles zijn een unieke lipidische media die een native bilaag-achtige omgeving te bieden terwijl ze zelf als oplosbaar gemaakt door detergenten. Deze eigenschap geeft bicelles een duidelijk voordeel ten opzichte van andere lipide-gebaseerde methoden kristallisatie aangezien er geen leercurve of gespecialiseerde apparatuur die nodig is voor deze techniek. Zodra bicelles beschikbaar zijn, zowel commercieel of bereid in het laboratorium, kunnen ze direct worden gemengd met gezuiverd eiwit en vanaf dit moment kristallisat...