Combinatie Radiotherapie in een orthotope Mouse hersentumor Model

Samenvatting

Het doel van dit artikel is het beschrijven van het gebruik van een orthotope glioblastoma model voor chemoradiatie studies. Dit artikel gaat echter cel verwerking, het implanteren, en radiotherapie van de muis met behulp van een intracraniële model.

Samenvatting

Glioblastoma multiforme (GBM) zijn de meest voorkomende en agressieve volwassen primaire hersentumoren ^1. In de afgelopen jaren is er aanzienlijke vooruitgang geboekt in het begrijpen van de mechanismen van tumor invasie en directe intracerebrale inoculatie van de tumor biedt de mogelijkheid van het observeren van de invasieve proces in een fysiologisch geschikte omgeving ^2. Voor zover de menselijke hersentumoren betreft, worden de orthotope modellen die nu beschikbaar is tot stand gebracht door stereotaxische injectie van celsuspensies of implantatie van een massief stuk van de tumor door middel van een ingewikkelde craniotomie procedure ^3. In de techniek wordt oogsten cellen van weefselkweek aan een celsuspensie gebruikt om rechtstreeks implanteren in de hersenen te maken. De duur van de behandeling is ongeveer 30 minuten, en de muis moet in een constante chirurgische vlak een injecteerbare verdoving wordt gebruikt. De muis is geplaatst in een stereotaxisch mal van Stoetling (figuur 1). Aftre het operatiegebied wordt gereinigd en wordt een incisie gemaakt, en de bregma bevindt zich de plaats van de craniotomie bepalen. De locatie van de craniotomie 2 mm naar rechts en 1 mm rostraal de bregma. De diepte van 3 mm van het oppervlak van de schedel en de cellen worden geïnjecteerd met een snelheid van 2 pi elke 2 minuten. De huid wordt gehecht met 5-0 PDS, en de muis is toegestaan ​​om wakker te worden op een verwarmingselement. Uit onze ervaring, afhankelijk van de cellijn kan de behandeling plaatsvinden van 7-10 dagen na chirurgie. Drug delivery is afhankelijk van de drug samenstelling. Voor bestraling de muizen zijn verdoofd, en in een op maat gemaakte mal. Lood heeft betrekking op de muis het lichaam en bloot alleen de hersenen van de muis. De studie van tumorvorming en de evaluatie van nieuwe therapieën voor GBM een nauwkeurige en reproduceerbare hersentumor diermodellen. Zo gebruiken we deze orthotope hersenen model om de interactie van de micro-omgeving van de hersenen en de tumor te bestuderen, aan de effectiven te testeness van de verschillende therapeutische middelen met en zonder straling.

Protocol

I. celpreparaat

1. De cellen worden gekweekt tot confluentie in DMEM met 10% FBS over een 80% confluent 225 cm ³ kolf per 5 muizen ingeplant.
2. Zuig media af van de cellen; wassen met 10 ml PBS zonder calcium of magnesium. Zuig het PBS uit cellen.
3. Trypsinize cellen met 3 ml trypsine, wacht 10-15 minuten, en neutraliseren van de trypsine met 15 ml van de media.
4. Pipetteer alle cellen en media in een 50 ml conisch. Twee grote flessen passen in een 50 ml conische.
5. Spin cellen bij 1600 rpm gedurende 7 min bij 4 ° C. Volledig aspireren supernatant. Resuspenderen cellen in 10 ml koud PBS, en spoel cellen zachtjes en neer te pipetteren. Zorg de celpellet gelijkmatig is gemengd met het PBS. De schorsing moet bewolkt.
6. Op dit moment een celgetal gebeurt met een Coulter Counter. De cellen opnieuw gecentrifugeerd bij 1600 rpm gedurende 7 min bij 4 ° C.
7. Na ^de 2e centrifugeren van de cellen,piraat alle PBS en resuspendeer in 1 ml PBS.
8. De cellen worden gecentrifugeerd in 1 ml PBS bij 3000 rpm gedurende 10 minuten bij 4 ° C. De PBS wordt afgezogen en PBS toegevoegd aan de eindconcentratie passen aan 1x10 ⁶ per 5 ul van U87 cellen kunnen andere cellijnen nodig een ander aantal en concentratie van cellen voor optimale groei van tumoren.
9. Na de laatste volume concentratie verkregen cellen op ijs gehouden in een eppendorf buisje.

II. Xenograft

1. Voorbereiden van de muis
   1. De muizen zijn verdoofd met behulp van een injectie mix van ketamine / xylazine / Saline. Het mengsel wordt 120 mg / kg Ketamine, 16 mg / kg Rompun en zoutoplossing. De muizen werden gewogen en individueel gegeven 0,1 ml per 10 g gebaseerd op het gewicht. De verdoving wordt gegeven met 26G naald tot 1 ml spuit IP. Het duurt ongeveer 15 min voor de muizen om een ​​slapende fase voor geen pijn reactie te bereiken. U kunt de pijn reactie van demuizen door te knijpen hun voetzool.
   2. Nadat de muis is volledig onder narcose gebracht, wordt oogzalf toegediend aan hun ogen om te voorkomen dat uitdrogen.
   3. De muis wordt geplaatst op het bed van de stereotaxische met de voorste boventanden in de inkeping op de mond bar. Het bed werd vervolgens geplaatst in de stereotaxisch.
   4. De neus wacht wordt geplaatst over de neus van de muis om beweging van het hoofd te voorkomen, en het oor bars zijn voorzichtig te plaatsen in de gehoorgang van de muizen. Zorg ervoor dat u een plaatsing van de neus of oor bar bars te strak te doen, als de schedel kunnen breken en / of te voorkomen dat de muis van de ademhaling.
   5. Zorg ervoor dat het hoofd van de muis is niveau met de streepjes op de stereotaxische is handig tijdens dit proces.
   6. Om prep de muis, alcohol en providine jodium wordt royaal aangebracht op de kop van de muis afwisselend voor een totaal van 3 Toepassing van alcohol en 3 toepassingen van jodium. Een laatste toepassing van een doekje met alcohol met 70% wordt toegepast ophet hoofd.
2. Chirurgische procedure
   1. Alle instrumenten van de procedure moet ofwel worden gesteriliseerd in de autoclaaf of onderdompelen instrumenten in 70% ethanol voor het begin van de procedure.
   2. Een incisie gemaakt op de schedel achter het rechteroog schuin naar links achterkant van de schedel. De incisie moet ongeveer 10 mm tot 15 mm lang.
   3. Met behulp van een Q-tip, langzaam scheiden de incisie aan de schedel bloot te leggen en weg te vegen het membraan dat tussen de schedel en de huid. Gebruik een wattenstaafje om het even welk bloed deppen en pas op voor overmatig bloedverlies.
   4. Ver top van de schedel van de bregma visualiseren. Met behulp van de Hamilton spuit punt, plaats deze over de bregma. De juiste positie van het gat te boren in de schedel 2 mm rechts en 1 mm voorste deel van bregma (figuur 2). Een chirurg vilt mondstuk marker, die wordt verkocht steriel wordt gebruikt om de plaats van de te boren gat markeren. Houd er rekening mee dat het gat dicht is gelegen aan de eenterior hechting.
   5. Vervolgens boort een klein gaatje in de schedel op de aangegeven positie met behulp van de punt van een 22G naald in een pin vaas of gevoed door middel van een 18G naald.
   6. Laad de 10 ul glazen Hamilton spuit met 5 pi van cellen. De Hamilton spuit is 10 pl met een stomp 30G tot 33G vaste naald die eraan verbonden zijn. Zorg ervoor dat de cellen te mengen voordat u ze, hetzij door pipetteren hen of het gebruik van een 1 ml spuit met een bijlage 25G naald. Na de Hamilton spuit is geladen, plaatst u deze terug in de arm om het line-up met het gat in de schedel.
   7. Laat de bunt uiteinde van de naald op het oppervlak van de schedel, wanneer de naald hoogte van de schedel, verlagen de naald tot het op een diepte van 3 mm onder het oppervlak van de schedel.
   8. Nadat de naald omlaag, stelt zij daar blijven gedurende 2 minuten aan een ernstig trauma van de naald die de hersenen te voorkomen. Implantatie van de cellen is met een snelheid van 1 pi per minuut voor een totaal van 6-8 minuten, wees voorzichtig met een backflow. Na de laatste van de cellen zijn geïmplanteerd, laat de naald op zijn plaats voor nog 2 minuten, zodat alle cellen om zich te vestigen binnen
   9. Verwijder de naald uit de hersenen, en maak het gat met een Q-tip. Ga naar de naald en spuit schoon met 50% aceton, 100% EtOH, en PBS, 3x in elke oplossing en in die volgorde.
   10. De huid op de schedel is klaar om te worden gehecht op dit punt. Met behulp van 5-0 PBS Sluit de incisie met ongeveer 3 steken.
   11. Laat de muis om wakker te worden op een warmte-pad, en opnieuw oogzalf indien nodig. De muis kan worden teruggestuurd naar de kooi na het toont beweging op zijn eigen (dat wil zeggen het opheffen van het hoofd of het verplaatsen van de schouders).

III. Behandeling van de IC-implantaat door straling and Drug

1. Bestraling
   1. Afhankelijk van de cellijn behandeling van de muizen kan plaatsvinden 5 nemen tot 7 dagen na de implantatie. Onze afdeling maakt gebruik van een Orthovoltage radiotherapie-eenheid voor straling traktatiement.
   2. Imaging zoals BLI (bioluminescentie) MRI of CT kan worden gebruikt om de tumor visualiseren vóór randomisatie (figuur 3A).
   3. De muizen zijn verdoofd met de Ketamine / Xylazine / zoutoplossing cocktail als voorheen, en oogzalf wordt toegepast op hun ogen.
   4. De muizen zijn geplaatst in een op maat gemaakte mal straling die is geconfigureerd als een taart wiel, waarbij de hoofden van de muizen wijzen naar het centrum. De lichamen van de muizen zijn afgeschermd van de straling met lood.
   5. Medicamenteuze behandeling kan worden gegeven voor of straling via verschillende routes de levering, dat wil zeggen SQ, IP en IV.

IV. Resultaten

De muis moet wakker te worden uit de procedure binnen 45-60 minuten na de anesthesie injectie. Als de muis heeft moeilijkheid wakker worden na de procedure en de tijd is meer dan 1 ½ uur na de procedure kan de muis niet te herstellen en euthanasie kan een effectief alternatief zijn. Als eEre is overmatig bloeden of de schedel wordt gekraakt op enig moment tijdens de procedure euthanasie wordt geadviseerd. Als alles goed gaat en afhankelijk van de cellijn, moet een tumor gaan vormen binnen 2-4 weken na de ingreep heeft plaats vinden. Bij het ​​gebruik van intracraniële xenotransplantaatmodellen, wordt de therapeutische werkzaamheid meestal gemeten als overleven na implantatie ^5. Echter, aangezien dit een IC-model tekenen en symptomen zal voorafgaand aan het overlijden plaatsvinden. Een deel van de lichamelijke tekenen met de muis kan vertonen een gebogen houding, verlies van lichaamsgewicht, en inactiviteit. Sommige van de neurologische symptomen kunnen aanvallen, hoofd kantelen, en het verlies van balans. Figuur 3B toont een HE van een tumor vlek op sterfte. Een Kaplan-Meier plot wordt gebruikt om de data (figuur 4) te evalueren. Het aantal dagen van overleving op 50% worden berekend en vergeleken met de controle. Als de combinatie groep leefde langer dan de toevoeging van de individuele straling en drug armen combinatie succesvol.

Figuur 1. Stoelting stereotaxisch apparatuur.

Figuur 2. Een diagram van de locatie van het boorgat in de muis schedel.

Figuur 3A. BLI beeldvorming na GBM implantatie.

Figuur 3B. H en E van de GBM tumor op sterfte.

Figuur 4. Resultaten van U87 IC implantaten geïnjecteerd met PARP-remmer 7 dagen na de operatie.

Discussie

Maligne gliomen, zoals glioblastoma multiforme, de meest algemeen voorkomende primaire hersentumoren en hebben een sombere prognose ^4. De overleving van patiënten die lijden aan GBM is nagenoeg ongewijzigd gebleven in het afgelopen decennium (dwz 9-12 maanden na de diagnose), ondanks de vooruitgang in de chirurgie, bestraling en chemotherapie ^5. De eigenschappen van een geschikt model voor de studie van glioma behandeling moet een reproduceerbare tumorlokalisatie en groei van de cellen relatief dis...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Lab Standaard stereotaxische Instrutment	Stoelting muis en rat-adapter
Betadine	100% EtOH
70% EtOH	50% aceton
6 "wattenstaafjes	Alcoholdoekjes
Hamilton spuit 80008	Ethicon 5-0 PD
1701 SN 31-33G / 1 "/ PT3 naald	1 ml spuiten
25G naalden	Verwarming pad
Kunstmatige Tears Zalf	Zeer fijne getipt permanent marker