De reverse genetics systeem voor de Rift Valley koorts virus MP-12 vaccinstam is een handig hulpmiddel voor het creëren van extra MP-12 mutanten met verhoogde verzwakking en immunogeniciteit. We beschrijven het protocol te genereren en karakteriseren NSS mutante stammen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Met behulp van reverse genetics aan de NSS-gen van de Rift Valley Fever virus MP-12 Strain om Vaccine veiligheid en effectiviteit te verbeteren manipuleren
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Rift Valley-koorts virus (RVFV), dat hemorragische koorts, neurologische aandoeningen of blindheid bij mensen, en een hoog percentage abortussen en foetale misvormingen bij herkauwers 1 veroorzaakt, is geclassificeerd als een HHS / USDA overlap te selecteren agent en een risico groep 3 ziekteverwekker. Het behoort tot het geslacht Phlebovirus in de familie Bunyaviridae en is een van de meest virulente leden van deze familie. Verschillende reverse genetics systemen voor de RVFV MP-12 vaccinstam 2,3 evenals wild-type stammen RVFV 4-6, waaronder ZH548 en ZH501, zijn ontwikkeld sinds 2006. De MP-12 stam (dat is een risico groep 2 ziekteverwekker en een niet-select agent) is sterk verzwakt door verschillende mutaties in de M-en L-segmenten, maar nog steeds draagt virulente S-segment RNA 3, die een functionele virulentie codeert factor, NSS. De RMP12-C13type (C13type) dragen 69% in-frame verwijderen van NSS ORF mist alle bekende NSS-functies, terwijl het repliceert als efficient doet als MP-12 in VeroE6 cellen ontbreekt type I IFN. NSS induceert een shut-off van gastheer transcriptie waaronder interferon (IFN)-bèta mRNA 7,8 en bevordert de afbraak van double-stranded RNA-afhankelijke proteïne kinase (PKR) op de post-translationele niveau. 9,10 IFN-beta is transcriptioneel opgereguleerd door interferon regulerende factor 3 (IRF-3), NF-kB en activator proteïne-1 (AP-1), en de binding van IFN-beta aan IFN-alpha/beta receptor (IFNAR) stimuleert de transcriptie van IFN-alfa genen of andere interferon gestimuleerde genen (ISGs) 11, welke host antivirale activiteiten induceert, terwijl gastheer transcriptie onderdrukking waaronder IFN-beta-gen door NSS voorkomt dat het gen upregulations van die ISGs in reactie op virale replicatie, hoewel IRF-3, NF-kB en activator proteïne-1 (AP-1) kan geactiveerd worden door RVFV7. . Zo NSS is een uitstekend doelwit verder te verzwakken MP-12 en voor het hosten aangeboren immuunrespons te verhogen door het afschaffen van de IFN-beta onderdrukking functie. HierBeschrijven we een protocol voor het genereren van een recombinant MP-12 codering gemuteerde NSS, en geven een voorbeeld van een screening methode om NSS mutanten die niet over de functie om IFN-beta mRNA-synthese onderdrukken identificeren. In aanvulling op haar essentiële rol in de aangeboren immuniteit, type-I IFN is belangrijk voor de rijping van dendritische cellen en de inductie van een adaptieve immuunrespons 12-14. Zo NSS mutanten het induceren van type I IFN worden verder verzwakt, maar tegelijkertijd efficiënter zijn op het stimuleren gastheer immuunreacties dan wild-type MP-12, waardoor ze ideale kandidaten voor vaccinatie benaderingen.
Protocol
1. Herstel van de recombinant MP-12 codering NSS mutatie (s) van plasmide DNA's 2
- Spread baby hamster nier (BHK) / T7-9 cellen 15, die stabiel uitdrukken T7-RNA polymerase, in 6-cm gerechten in Minimum Essential Medium (MEM)-alpha (Invitrogen, Cat # 32561037) met 10% foetaal bovine serum (FBS ), penicilline-streptomycine (Penicilline: 100 U / ml, streptomycine: 100 ug / ml) (Invitrogen, Cat # 15140122), en 600 pg / ml hygromycine B (Cellgro, Cat # 30-240-CR).
* De efficiëntie van virale herstel is hoger in 6 cm schalen dan in 35-mm gerechten. BHK/T7-9 cellen met een lage passage level support hogere tarieven van herstel. U kunt o....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Reverse genetics voor RVFV zijn ontwikkeld door verschillende groepen door gebruik te maken van T7-promotor 2,4,5 of muis 3 of 4 mensen pol-I promotor. In dit manuscript beschrijven we een protocol om recombinant RVFV MP-12-stammen te genereren door gebruik te maken BHK/T7-9 cellen 15 die stabiel uitdrukken T7 RNA-polymerase. De efficiëntie van virale herstel gevarieerd afhankelijk van de conditie van BHK/T7-9 cellen, de hoogte van plasmiden, het aantal getransfecteerde cellen.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
We hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door Grant Nummer 5 U54 AI057156-07 door de Western Regional Center of Excellence (WRCE), een R01 AI08764301-A1 van Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten, en een interne financiering van Sealy Center for Vaccine Development aan de Universiteit van Texas Medical Branch.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogus nummer | Commentaar (optioneel) |
| Minimum Essential Medium (MEM)-alpha | Invitrogen | 32561037 | |
| Gewijzigde minimum Dulbecco's essentieel medium | Invitrogen | 11965092 | |
| Modified Eagle Medium (MEM 2x) | Invitrogen | 11935046 | |
| Penicilline-streptomycine | Invitrogen | 15140122 | |
| Hygromycine B | Cellgro | 30 tot 240-CR | |
| Tryptose fosfaat bouillon | MP Biomedicals | 1682149 | |
| Noble agar | VWR | 101170-362 | |
| Transit-LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | |
| Aerosol strakke deksel | Eppendorf | C-2223-25 | |
| 0,33% neutraal rood oplossing | Sigma Aldrich | N2889-100ML | |
| C57/WT MEF cellen | InvivoGen | MEF-c57wt | |
| Blasticidine S | InvivoGen | Ant-bl-1 | |
| Zeocin | InvivoGen | ANT-zn-1 | |
| Kwantitatieve-Blue | InvivoGen | vertegen-QB1 | |
| BHK/T7-9 cellen 15 | Gifu universiteit, Japan | ||
| Vero-cellen E6 | ATCC | CRL-1586 |
Referenties
- Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. Rift Valley fever virus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, an....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
