Method Article

Murine Oppervlakkige lymfkliertest Chirurgie

DOI:

10.3791/3444

⸱

May 21st, 2012

 , 
1Maisonneuve-Rosemont Hospital Research Center, 2Department of Microbiology and Immunology, University of Montreal, 3Department of Medicine, University of Montreal

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de progressie van een immuunrespons na verloop van tijd in dezelfde muis volgen, kunnen de lymfeklieren achter elkaar worden verwijderd door een operatie. Hier wordt beschreven hoe deze techniek kan worden uitgevoerd.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Op het gebied van de immunologie, om de progressie van een immuunrespons tegen een vaccin, een infectie of tumor te begrijpen wordt de reactie vaak tijd te volgen. Ook de studie van lymfocyten homeostase vergt tijd natuurlijk experimenten. Het uitvoeren van deze studies in dezelfde muis is ideaal om de experimentele variabiliteit en het aantal muizen gebruikt verminderen. Blood terugtrekking kan uitvoeren van tijdsverloop experimenten maar geeft slechts over circulerende lymfocyten en geeft een beperkt aantal cellen 1-4. Sinds lymfocyten circuleren door het lichaam en die woonachtig zijn in de lymfeklieren hebben verschillende eigenschappen, is het belangrijk om te onderzoeken beide locaties. De sequentiële verwijdering van lymfeklieren door een operatie biedt een unieke gelegenheid om een ​​immuunrespons of immuun cel expansie in dezelfde muis over de tijd te volgen. De techniek levert tussen 1 2x10 6 cellen per lymfeknoop die voldoende is om ierform fenotypische karakterisering en / of functionele assays. Sequential lymfklier operatie of lymfadenectomie is met succes gebruikt door ons en anderen 5-11. Hier beschrijven we hoe de arm en lies lymfeklieren kan worden verwijderd door een kleine incisie in de huid van een narcose muis. Sinds de operatie is oppervlakkig en snel gedaan, de muis herstelt heel snel geneest goed en niet een overmatige pijn. Elke tweede dag, is het mogelijk om oogsten een of twee lymfeknopen waardoor tijdsverloop experimenten. Deze techniek is dus geschikt om de eigenschappen van lymfeknoop-verblijvende lymfocyten bestuderen tijd. Deze aanpak is geschikt voor verschillende experimentele ontwerpen en wij geloven dat veel laboratoria baat zouden hebben bij het uitvoeren van opeenvolgende lymfeknoop operaties.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding voor de operatie

Muizen werden behandeld in overeenstemming met de Canadese Raad voor Dierenaangelegenheden Care richtlijnen.

  1. Verdoven muizen door injectie van ketamine / xylazine (150/300 mg / kg, ip) of door inhalatie van isofluraan (2% 1L zuurstof). Indien beschikbaar is, dient isofluraan worden gebruikt als het zorgt voor een betere controle van de narcose tijd en diepte. Ook is zuurstof toegediend op hetzelfde moment waarop de fysiologische functies van het dier ondersteunt. Bovendien wordt isofluraan direct geëlimineerd door de longen en dus vereist geen lever-of nierproblemen metabolisme.
  2. Injecteer buprenorfine (0,05 - 0,1 mg / kg, sc) of een andere analgeticum.
  3. Breng zalf op de muis ogen voor de operatie om droge ogen te vermijden (indien van isofluraan wordt gebruikt).
  4. Controleer of de muis in slaap is door te knijpen zijn poot en rollend zijn staart. Als de muis niet reageert, ga dan verder met de operatie.

2. De operatie

Het is mogelijk 4 verwijderen van de oppervlakkige lymfeknopen (LN) door chirurgie: de twee inguinale en 2 arm. De isolatie van LN gemakkelijker in jonge magere muizen (6-8 weken), aangezien de aanwezigheid van vetweefsel oudere muizen kunnen interfereren met LN isolatie. Echter wordt deze beperking te overwinnen bij herhaalde praktijk. Voor de muizen comfort, oogsten we een maximum van 2 LNS in een tijd en als we tijd-gangen-experimenten uit te voeren, oogsten we LNS om de dag. Ook, om infectie te voorkomen, kan antibiotica worden gegeven aan de muis, maar wij niet en de wonden zijn genezen prima. Men moet er rekening mee dat afhankelijk van de experimentele ontwerp, het gebruik van een antibioticum kunnen beïnvloeden resultaat waargenomen (bijvoorbeeld als een reactie op een bacterie gemeten). Merk op dat alle instrumenten worden gesteriliseerd na elk gebruik en aseptische omstandigheden worden gehandhaafd tijdens de gehele procedure.

  1. Plaats de muis op zijn kant.
  2. Lokaliseer de regio waar u uitvoeren van een incision, afhankelijk van de LN u oogsten. (Figuur 1).
  3. Toepassen chloorhexidine of een desinfectiemiddel, die regio.
  4. Een kleine insnijding met schaar (ongeveer 5 mm) hetzij aan de achterkant van het onderbeen of boven de achterpoot bij buik (figuur 1).
  5. Verwijder de losse haren die u hebt gesneden met de tang. Als u wilt, kunt u de muis scheren voor het maken van de incisie. Echter, het verlengt de procedure en we vinden dat het niet nodig is, aangezien, zoals hier wordt getoond, niet is verbeterd genezing of vermindering van infectie, die beide zeer zeldzaam.
  6. Strek de incisie met 2 tangen om de LN te zien. De incisie kan oplopen tot 10 mm. De LN verschijnt grijs of donkerder dan de omringende vet.
  7. Knijp de fascia (de dunne membraan dat het vet en weefsel) op de top van de LN met een pincet en trek voorzichtig zonder het omringende weefsel.
  8. Plaats tweede tang zoveel mogelijk underneath de LN. Met de eerste tang, breek de fascia en verwijder de LN. Als u met succes de geoogste LN, moet een vlek van bloed verschijnen op de plaats waar de LN eerder werd gevestigd. Merk op dat de LN zinkt in een isotone oplossing. Deze eenvoudige test kunt u controleren of u een LN en niet vetweefsel gewonnen.
  9. Controleer of er geen haren in de wond.
  10. Sluit de insnijding door het steken van de twee delen van de huid elkaar (de binnenzijde van de huid) en nieten met een clip. Wij gebruiken een aantal Michel Clip met het toepassen van een tang. Plaats een of twee clips afhankelijk van de grootte van de insnijding. Meestal de clips vallen wanneer het weefsel geneest.

3. Postoperatieve zorg

  1. Voeg wat natvoer de bodem van de kooi, zodat de muizen gemakkelijk voeden na de operatie.
  2. Ongeveer 6 tot 8 uur na de operatie, controleert u de muizen om ervoor te zorgen dat ze geen pijn ervaren. Let zorgvuldig op hun gedrag (houding, manier van lopen, ininteractie met de congeneer en het uiterlijk van de vacht). Als de totale uitstraling van de muizen is slecht, het beheren van een tweede dosis van buprenorfine. De volgende dag de muizen moeten weer hun normale gedrag anders doorgaan met de toediening van buprenorfine. De muizen mag nooit bij de eindpunten vooraf bepaald en geaccepteerd door uw Animal Care Raad. Wellicht wilt u advies in te winnen van en naar uw verzorging van dieren terrarium technicus te helpen.

4. Lymfkliertest Handling

  1. In het laboratorium, op een enkele cel suspensie te verkrijgen, distantiëren de LN als je per gebruikelijke procedure. We kiezen LN tegen mat dia's en routinematig te verkrijgen 1-2 x 10 6 cellen per LN. Als alternatief, bereiden we de LN voor RNA-extractie.
  2. Vlekken op de cellen als per uw gebruikelijke protocol. U moet krijgen naar verwachting LN flowcytometrie profielen.

5. Representatieve resultaten

Een voorbeeld van voorwaartse en zijwaartse verstrooiing ppartij wordt getoond LNS geoogst van een verdoofd muizen door een operatie of een opgeofferd muis (figuur 2). Het profiel en de percentages van cellen in de live-lymfocyt gate zijn gelijk aan te tonen dat LN chirurgie is een geschikte techniek om te oogsten cellen.

figure-protocol-1
Figuur 1. Lies en arm LN lokalisatie in de muis. A. de lies LN bevindt zich net boven de achterpoot, iets in de richting van de buik. B. De arm LN bevindt zich achter het voorbeen.

figure-protocol-2
Figuur 2. Flowcytometrie profiel van lymfocyten die wordt verkregen na LN chirurgie. Vooruit en zijwaartse verstrooiing profielen worden getoond voor LNS geoogst van een Anesthetized muis door een operatie (A) of van een geofferd muis (B). LNS werden geoogst, gescheiden en geanalyseerd op een flow cytometer. Percentages van cellen in levende lymfocyten poort weergegeven.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben beschreven een protocol van LN operatie die kan worden toegepast op een groot aantal experimentele systemen. Hoewel het zeer nuttig om te volgen immuunreacties of immuuncellen homeostase, deze techniek heeft een aantal beperkingen. Ten eerste kan slechts vier LNS worden geoogst. Ten tweede moet de bestudeerde immuunrespons zijn systemische of voorkomen in de oppervlakkige inguinale of brachiale (huid-drainage) LNS. Tenslotte wordt het aantal geoogste cellen beïnvloed door de kwaliteit van de LN verwijdering, t...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Sylvie Lesage en alle lab-leden voor de kritische lezing van het protocol. Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​(MOP-77545) van de Canadese Institutes of Health Research (CIHR). Nathalie Labrecque wordt ondersteund door een FRSQ Senior Scholarship en Melissa Mathieu kreeg een NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagens Naam Vennootschap Catalogusnummer Reacties
Graefe Fine Patroon Premium tang Harvard Apparatuur 52-2144 Sterk gebogen, 10 cm (4 in), 0,8 mm tip
Michel Clip toepassen en verwijderen tang Harvard Apparatuur 52-3779 12,5 cm (5 cm)
Michel Clip 100 Harvard Apparatuur 52-3746 7.5-1.75 mm
Temgesic (buprenorfinehydrochloride) Schering-Plough
Vetalar (Ketamine hydrochloride) Boniche Animal Healthcare DIN: 01989529
Rompun (xylazine) Bayer DIN: 02169592
Isofluraan ABBOTT DIN: 02032384
Hypotears oogzalf Novartis Ophtalmics DIN: 02133288
Baxedin (Clorhexidine gluconaat 2% in isopropylalcohol 70%) Omega L0000017 DIN: 02251477

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen. Nature. 458, 211-214 (2009).
  2. Vezys, V. Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience. Nature. 457, 196-199 (2009).
  3. Zhou, X. Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1. Immunity. 33, 229-240 (2010).
  4. Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes. J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).
  5. Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses. Immunity. 7, 123-134 (1997).
  6. Witherden, D. Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules. J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).
  7. Labrecque, N. How much TCR does a T cell need. Immunity. 15, 71-82 (2001).
  8. Leignadier, J., Labrecque, N. Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation. PLoS One. 5, e13740(2010).
  9. Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).
  10. Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response. J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).
  11. Bassett, J. D. CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells. Blood. 117, 1146-1155 (2011).
  12. Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization. J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).
  13. Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation. Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lymph Node SurgeryMurine Lymph NodeBrachial Lymph NodeInguinal Lymph NodeLymph Node RemovalSequential Lymph NodeLymph Node HarvestingSingle Cell SuspensionFlow Cytometry AnalysisIsotonic Solution

Related Articles