Methodenartikel

Teeltmateriaal en Detecteren van een besmettelijke moleculaire kloon van Maedi-visna virus dat Green Fluorescent Protein geeft uiting aan

9.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/3483

⸱

9 oktober 2011

 , 
1Institute for Experimental Pathology, University of Iceland

In dit artikel

Samenvatting

Beschrijven we een moleculaire kloon van maedi-visna virus dat GFP tot uitdrukking en is volledig besmettelijk. Replicatie van dit virus kan worden gedetecteerd door gebruik te maken van fluorescentie microscopie en flowcytometrie.

Samenvatting

Maedi-visna virus (MVV) is een lentivirus van schapen, waardoor langzaam progressieve interstitiële pneumonie en encefalitis 1. Het primaire doel cellen van MVV in vivo worden beschouwd als van de monocyten Lineage 2. Bepaalde stammen van MVV kunnen repliceren in andere celtypen, maar 3,4. De groen fluorescerend eiwit is een veelgebruikte marker voor het bestuderen van lentivirussen in levende cellen. Wij hebben geplaatst het EGFP-gen in het gen voor dUTPase van MVV. De dUTPase gen is goed geconserveerd in de meeste lentivirus stammen van schapen en geiten en is aangetoond dat het belang in de replicatie van CAEV 5. Er is echter dUTPase aangetoond dat misbaar voor replicatie van de moleculaire kloon van MVV die in deze studie zowel in vitro als in vivo 6. MVV-replicatie is strikt beperkt tot cellen van schapen of geiten herkomst. We maken gebruik van een primaire cel lijn van de plexus choroideus van schapen (SCP cellen) voor transfectie en vermeerdering van het virus 7. De fluorescerende MVV is volledig aanstekelijk en EGFP expressie is stabiel gedurende tenminste zes passages 8. Er is een goede correlatie tussen de metingen van TCID 50 en EGFP. Dit virus zou dan ook handig zijn voor snelle detectie van geïnfecteerde cellen in studies van celtropisme en pathogeniciteit in vitro en in vivo 8.

Protocol

1. Transfectie

De moleculaire kloon is opgenomen in twee plasmiden, p8XSp5-EGFP en p67r van 12 kb en 4,5 kb respectievelijk. 9,10

  1. Snijd equimolaire hoeveelheden van de twee plasmiden, dat wil zeggen 4,4 ug van p8XSp5-EGFP en 1,6 ug van p67r met Xbal en afbinden voor transfectie.
  2. Voor ligatie, gebruik 1 Weiss eenheid van ligase in een 50 ul reactie en incubeer bij 16 ° C gedurende de nacht.
  3. Wanneer ligatie is voltooid, incubeer de ligatie mix bij 65 ° C gedurende 15 minuten voor inactivatie van de ligase. Deze stap kan worden overgeslagen.
  4. Twee dagen voor transfectie, zaad 10 6 SCP cellen in een T25 weefselkweek fles, en te groeien cellen voor twee dagen in 5 ml DMEM + 10% lam serum en 2 mM glutamine, zonder antibiotica om een monolaag van 90% confluentie. Als de cellen nog niet hebben bereikt 90% confluentie na twee dagen, laat de cellen om een ​​extra dag te groeien.

Opmerking: Het lam serum kan worden vervangen door foetale bovine serum (FBS). We routinematig gebruik van lamsvlees serum, omdat sommige stammen van MVV worden geremd door FBS, dit MVV stam wordt niet geremd door FBS, echter.

  1. Wanneer de cellen klaar zijn voor transfectie, verandering middellange tot DMEM met 1% serum (lam serum of FBS) zonder antibiotica.
    Wij gebruiken Lipofectamin 2000 (Invitrogen) voor transfectie.
  2. Verdun het DNA in 500μl Opti-MEM medium.
  3. Verdunnen 20μl Lipofectamin 2000 in 500μl Opti-MEM medium en laat op kamertemperatuur (RT) gedurende 5 minuten.
  4. Na de 5 min incubatie, combineren de verdund DNA met verdunde Lipofectamine 2000 (totaal volume = 1000 pi). Meng voorzichtig en incubeer 20-30 minuten bij RT.
  5. Voeg de transfectie mix (1 ml) om de T25 fles met SCP cellen en het medium (5 ml). Meng door zachtjes wiegen.
  6. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 's nachts (18 - 24 uur).
  7. Wijzig medium de volgende dag om DMEM met 1% serum, 2mm glutamine, 100IU penicilline en streptomycine 100IU.
  8. Bewaken van de productie van GFP in het SCP-cellen door omgekeerde fluorescentie microscopie. Lage transfectie-efficiëntie kan worden verwacht met deze primaire cellen, meestal 5 - 15%.
  9. Incubeer verder bij 37 ° C, 5% CO 2 voor een aantal dagen om verspreiding van het virus in de kolf. Het duurt meestal 7-14 dagen voor de volledige infectie.
  10. Verzamel dan het virus door aliquoting de supernatant in Eppendorf buizen. Spin in een microcentrifuge bij 3000 rpm gedurende 5 minuten naar cel vuil te verwijderen. Breng de bovenstaande met het virus om nieuwe buizen. Bewaren bij -80 ° C.

2. Titratie van virus

  1. Zaad 3x10 4 SCP cellen in 100 ul DMEM-medium aangevuld met 10% serum, 2mm glutamine, 100IU/ml penicilline en streptomycine 100IU/ml, per putje in een 96 wells plaat. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2.
  2. Als de cellen confluent de volgende dag, verander middellange tot DMEM met 1% serum, 2mm glutamine, 100IU/ml penicilline en streptomycine 100IU/ml, 100 pl in elk putje.
  3. Verdun het virus op de volgende manier:
    1. Voeg 180 ul DMEM met 1% serum, 2mm glutamine, 100IU/ml penicilline en streptomycine per 100IU/ml goed voor 4 x 10 putten in een 96 goed met ronde bodem of V-bodemplaat.
    2. Voor seriële tienvoudige verdunningen in viervoud, voeg 20 ul van het virus aan elk van 4wells in de eerste kolom van de plaat, en het gebruik van een vier-kanaals pipet, pipet op en neer om ervoor te zorgen dat de monsters goed gemengd zijn. Verandering pipetpunten en overdracht 20 ui naar de volgende vier putten en ga zo maar door. Laat de laatste putten zonder virus voor een negatieve controle.
  4. Voeg 100 ul van het virus verdunningen het SCP cellen en medium.
  5. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2. Let op voor GFP fluorescentie en cytopathische effecten voor twee weken.
    Cytopathische effecten bestaan ​​uit cellen worden afgerond en minder transparant dan normale cellen met processen uit te rekken, eindigend met multinucleaire cellen verschijnen en celdood.
  6. Bereken virus titer (TCID50) met behulp van de Reed Muench methode 11.

3. FACS-analyse van de geïnfecteerde cellen

Opmerking: Voor een snelle controle van de replicatie van het virus, geïnfecteerde cellen kunnen worden onderzocht door middel van flowcytometrie.

  1. Trypsinize geïnfecteerde cellen (ca 10 5), was 1x met PBS en resuspendeer in 500μl PBS.
  2. Voeg 500 ul 4% paraformaldehyde-oplossing (2% eindconcentratie), incubeer bij RT gedurende 30 minuten.
  3. Pellet-cellen in een microcentrifuge bij 3000 rpm gedurende 5 minuten.
  4. Was met PBS 2x5 min en analyseren op een FACScan analyzer. Tellen 10.000 evenementen.

4. Representatieve resultaten:

Dit virus moeten volledig besmettelijk en repliceren naar een titer van 10 juni-10 juli TCID 50 / ml. Geïnfecteerde cellen fluorescerende en kunnen worden detected door flowcytometrie en fluorescentie microscopie. Meestal kan GFP opgespoord worden in meer dan 60% van de cellen in de geïnfecteerde cel kweken met behulp van flowcytometrie (afb. 1). Ook wanneer gevisualiseerd door fluorescentie microscopie, een meerderheid van de cellen fluorescent (Fig. 2A en B).

Figuur 1
Figuur 1. FACScan analyse van de SCP-cellen geïnfecteerd met KV1772-EGFP virus na 7 dagen van de infectie.

Figuur 2
Figuur 2. Fase contrast microscopie van SCP-cellen geïnfecteerd met KV1772-EGFP na 7 dagen incubatie (A). Dezelfde cellen gevisualiseerd door fluorescentie microscopie (B).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De GFP uitdrukken moleculaire kloon van MVV hier gepresenteerde moet nuttig zijn voor het analyseren van de gastheer-cel interacties en pathogeniteit van de MVV zowel in vitro als in vivo. Het virus verkregen na 7-14 dagen van replicatie heeft ongetwijfeld verworven sommige mutaties als gevolg van de onnauwkeurigheid van reverse transcriptase. Er zijn echter beperkingen aan het gebruik van deze kloon als een enkele cyclus vector. Een daarvan is dat het gebruik van de kloon is beperkt tot cellen van schapen en geiten oor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door de IJslandse Research Fund en de Universiteit van IJsland Research Fund.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van het serum Vennootschap Catalogus nummer
DMEM Gibco 10938025
Opti-MEM Gibco 51985018
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019

Referenties

  1. Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).
  2. Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes. J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).
  3. Andresdottir, V. Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus. Virus Genes. 16, 281-293 (1998).
  4. Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence. Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).
  5. Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions. J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).
  6. Petursson, G. Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity. J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).
  7. Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. Cultivation of visna virus in tissue culture. Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).
  8. Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein. J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).
  9. Andresson, O. S. Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus. Virology. 193, 89-105 (1993).
  10. Skraban, R. Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype. J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).
  11. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
  12. Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity. Virology. 279, 116-129 (2001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cellen van de plexus choroideus van schapenfluorescentiemicroscopieflowcytometrievirale titratie assayTCID50 metingplasmidetransfectieviruspropagatiecytopathische effecten

Gerelateerde artikelen