Monitoring eiwitadsorptie met Solid-state Nanoporiën

Samenvatting

Een methode van het gebruik van solid-state nanoporiën om de niet-specifieke adsorptie van eiwitten te controleren op een anorganisch oppervlak is beschreven. De methode maakt gebruik van de resistieve-puls principe, waardoor de adsorptie aan gezocht worden in real-time en op de single-molecule-niveau. Omdat het proces van enkel eiwit-adsorptie wordt ver van evenwicht, stellen wij de werkgelegenheid van parallelle arrays van synthetische nanoporiën, waardoor voor de kwantitatieve bepaling van de schijnbare eerste orde reactie snelheidsconstante van eiwitadsorptie evenals en de Langmuir adsorptie constant.

Samenvatting

Solid-state nanoporiën zijn gebruikt om metingen uit te voeren op de single-molecule niveau naar het lokale structuur en flexibiliteit van nucleïnezuren ^1-6, het ontvouwen van eiwitten ^7, en de bindingsaffiniteit van verschillende liganden ^acht te onderzoeken. Door het koppelen van deze nanoporiën om de resistieve-pulstechniek ^9-12, kan dergelijke metingen worden gedaan onder een breed scala van omstandigheden en zonder de noodzaak voor etikettering ^3. In de resistieve-pulse-techniek, is een ionisch zout-oplossing geïntroduceerd op beide zijden van de nanogaatje. Daarom zijn ionen verdreven uit de ene kant van de kamer naar de andere door een toegepaste transmembraan potentieel, wat resulteert in een constante stroom. Het partitioneren van een analyt in de nanogaatje veroorzaakt een goed gedefinieerde doorbuiging in de huidige, die kan worden geanalyseerd om single-molecule informatie eruit te halen. Met behulp van deze techniek kan de adsorptie van enkele eiwitten aan de nanogaatje muren worden gecontroleerd onder een breed scala aanvoorwaarden ^13. Eiwit-adsorptie wordt steeds belangrijker, want als microfluïdische apparaten krimpen in omvang, de interactie van deze systemen met enkele eiwitten wordt een punt van zorg. Dit protocol beschrijft een snelle test voor eiwit binding aan nitride films, die gemakkelijk kan worden uitgebreid tot andere dunne films vatbaar voor nanogaatje boren, of om gefunctionaliseerde oppervlakken nitride. Een verscheidenheid van eiwitten kunnen worden bestudeerd onder een breed scala aan oplossingen en denaturerende omstandigheden. Bovendien kan dit protocol worden gebruikt om meer fundamentele problemen met behulp van spectroscopie nanogaatje te verkennen.

Protocol

1. Vervaardiging van solid-state nanoporiën in silicium nitride membranen

1. Breng de FEI Tecnai F20 S / TEM tot een versnelling spanning van 200 kV. Bij gebruik van een ander S / TEM, moet de versnelling spanning groter dan of gelijk aan 200 kV ⁹
2. Laad een 20 nm dikke SPI siliciumnitride venster rooster in de TEM monster houder en schoon met zuurstof plasma gedurende 30 seconden om alle verontreinigingen te verwijderen uit de houder.
3. Laad het monster in de S / TEM en zorgen voor de vacuüm pomp naar beneden. Zodra de S / TEM heeft gepompt tot vacuüm, vinden de nitride raam in bright-field TEM-modus door te zoeken naar een heldere plein aan de Ronchigram. Zorg ervoor dat de TEM goed is uitgelijnd, maak er een nette en focus van het monster.
4. Schakel de S / TEM in de STEM-modus. Gebruik de HAADF (of equivalent) detector om het imago van de monster en zorg ervoor dat het goed is uitgelijnd.
5. Stel de Monochromator op een lage waarde. Een lagere waarde van de Monochromator zorgt voor een hogere valutat van elektronen beschikbaar zijn voor het boren. Als het S / TEM heeft geen Monochromator, deze stap overslaan.
6. Selecteer een geschikte plek formaat voor het boren van de nanogaatje. Dit komt overeen met de diameter van de elektronen probe. Een 3 nm sonde werkt goed voor het boren van 5 nm diameter poriën. Een grotere sonde (5 nm) zal sneller boren en creëren een grotere poriën. Een kleinere sensor (1 nm) zal het langer duren om te boren en een kleinere porie.
7. Stel de STEM uitlijningen, indien nodig.
8. Focus van de nitride membraan en breng het naar een vergroting van x1.3M. Fijn scherpstellen moet worden gedaan door het toezicht op de Ronchigram.
9. Als er een beweging van het monster, wacht dan op het monster te stabiliseren. Dit kan tot een uur. Lege de elektronenbundel terwijl u wacht, zodat er geen schade van de nitride.
10. Plaats de elektronen probe op het monster en beginnen boren.
11. Controleer regelmatig het monster door het scannen met de HAADF detector, zowel om te controleren of de nanogaatje is dri wordtgelogen (het zal er uitzien als een donkere vlek) en om te controleren of er is geen beweging van het monster. Als het monster zweeft een beetje, de positie van het elektron sonde op meer dan de nanogaatje.
12. Bekijk de Ronchigram te identificeren wanneer de porie heeft gevormd. Toen in focus, het nitride film heeft een glanzende uitstraling. Dit zal verdwijnen wanneer de nanogaatje formulieren. Aanbrengen van de Ronchigram enigszins onscherp maakt het mogelijk om te zien een Fresnel franje worden geassocieerd met het nanogaatje.
13. Maak een beeld van de nanogaatje met de HAADF.
14. Doe een intensiteit profiel van de nanogaatje beeld. De diameter van de nanogaatje kan geschat worden door de donkerste gebied van het profiel.
15. Uitbreiding van de nanogaatje kan worden uitgevoerd door het verplaatsen van de elektron sonde langs de randen van de porie.
16. Zodra de nanogaatje is van de gewenste diameter, zet de S / TEM in de TEM-modus.
17. Breng de Monochromator om de standaard instelling en het imago van de nanogaatje met behulp van bright-field TEM om de grootte te bevestigen (Afb. 1).

2. Bevochtiging van de solid-state nanogaatje

1. De-gas gedeïoniseerd water met 1 M KCl, 10 mM kalium-fosfaat, pH 7,4. Dit kan worden gedaan door de oplossingen onder vacuüm en ze in een bad ultrasoonapparaat gedurende 20 minuten.
2. Plaats de nanogaatje met silicium nitride chip in een 10 ml Pyrex beker. Zorg ervoor dat u de nitride raam te breken want het is zeer delicaat. Plaats het bekerglas op een kookplaat in een zuurkast en ingesteld op 100 ° C.
3. Reinig de nanogaatje chip met piranha oplossing met behulp van grote zorg. Voegt u eerst 3 ml zwavelzuur om de container met behulp van een glazen pipet. Vervolgens voeg voorzichtig 1 ml waterstofperoxide aan het zwavelzuur aan piranha-oplossing ¹⁴ te maken. Neem alle voorzorgsmaatregelen.
4. Laat de nanogaatje chip in de piranha-oplossing inwerken gedurende 10 minuten.
5. Verwijder de piranha-oplossing uit de beker met behulp van een glazen pipet. Plaats deze in een juiste opslag bakje.
6. Fill de beker met de ontgast, gedeïoniseerd water met een schone glazen pipet. Lege beker water en herhaal minstens 5 keer.
7. Verwijder de nanogaatje chip met schone pincet en droog het met licht zuigen
8. Onmiddellijk seal de nanogaatje chip in de kamer (Fig. 2a, 2b). De chip kan worden vastgezet in de kamer door O-ringen of siliconenkit.
9. Vul de kamer met KCl-oplossing
10. Sluit de Ag / AgCl elektroden op de kamer (Fig. 2b). Elektroden kunnen worden gemaakt door het weken zilveren draad in bleekwater 's nachts.
11. Breng een transmembraan potentiaal over de elektroden en toezicht op de huidige reactie met behulp van een Axon 200B patch-clamp versterker in de voltage-clamp-modus.
12. Construct een I / V (stroom-spanning) curve van de metingen. De I / V-curve moet zeer lineair bij het ​​gebruik van 1 M KCl (afb. 3). De geleiding van de nanogaatje moeten overeenstemmen met de diameter. Als de nanogaatje niet wordt weergegeven eenlineaire I / V-curve, de geleiding is te laag, of de open stroom van de nanogaatje is niet stabiel (Fig. 4a), betekent dit dat de nanogaatje niet goed bevochtigd en piranha wassen moet worden herhaald.

3. Monitoring eiwitadsorptie

1. Het is van cruciaal belang om de controle experimenten uit te voeren met een single-nanogaatje membraan of parallel array van nanoporiën (zie hieronder) om de huidige monitor met de buffer voorwaarden ontbreekt het eiwit monster. Wij raden de volgende twee stappen: (i) het gebruik van een hoge zuiverheid niveau buffer (zuiverheid> 99,9%; chromatografie-grade niveau), en (ii) het gebruik van een buffer waarvan de wisselwerking met de solid-state nanogaatje niet produceren single-channel evenementen. Daarnaast raden we het verkrijgen van een hoge zuiverheid eiwitmonster het gebruik van standaard eiwit chemie procedures. De zuiverheid van het eiwit monster moet worden gecontroleerd door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide (SDS-PAGE) gel-analyse en hoge-resolutie mass spectrometrie ^15.
2. Voeg een gezuiverd monster van het eiwit te bestuderen in de geaard bad van de kamer. Wacht tot het monster te diffunderen door het bad. Typische concentraties van eiwit dat kan worden gemeten zijn in de tientallen nM tot uM range ^7,15-21.
3. Breng een transmembraan potentiële spanning vooringenomenheid met de polariteit tegengesteld aan die van de totale lading van het eiwit bestudeerd. Bijvoorbeeld, BSA heeft een effectieve netto negatieve lading bij pH 7,4, en dus een positieve spanning misvatting moet worden toegepast. De aangelegde spanning creëert potentiaalgradiënt binnen de nanogaatje interieur en proteïnen van tegengestelde ladingen zal worden gedreven door tegengestelde krachten. Alleen voltage polariteiten die de eiwitten schijf in de nanogaatje zullen creëren van meetbare signalen.
4. Een toegepast potentieel van grootte van 200 mV moet groot genoeg zijn om de meeste eiwitten analyten te observeren. Gebeurtenissen zullen verschijnen als tijdelijke stroom doorbuigingen van de baseline (fig. 4b).Als er geen signaal wordt waargenomen, verhoogt de concentratie van het eiwit in de kamer. Hogere spanningen verbeteren van de signaal-ruisverhouding. Nitride nanoporiën kan weerstaan ​​enkele volts.
5. Eiwit adsorptions zal verschijnen als langlevende veranderingen in de baseline stroom van de nanogaatje (fig. 4c).

4. Mogelijkheden voor functionalisering van de nanoporiën

Er bestaan ​​verschillende methoden voor het aanbrengen van functionele groepen aan silicium nitride ^22,23. De meeste nitride films hebben een dunne oxidelaag aan de buitenkant en de blootstelling aan ozon kan een extra oxidelaag, indien nodig. Verschillende organosilanen kan worden gebruikt en zelf-geassembleerde op dergelijke lagen. Van bijzonder belang is aminosilaan, die zichzelf assembleert en kan worden gewijzigd verder (dat wil zeggen, carbonzuur en aldehyden), waardoor de inspectie van een reeks van organische oppervlakken. Na een nanogaatje is gewassen met piranha en vastgezet in de chamber, kan amine direct worden toegevoegd aan de kamer bad met een ondersteunend elektrolyt van 0,5 M TBACl (tetrabutylammonium) en watervrij MeOH (methanol) gebruikt als een oplosmiddel. Monolaag vorming kan gevolgd worden door de toepassing van een 400 mV spanning vooroordelen en de meting van de huidige daling van ^23.

5. Bepaling van de schijnbare eerste orde reactie snelheidsconstante en de Langmuir adsorptie constante gebruik van parallelle nanogaatje arrays

5.1 De schijnbare eerste-orde reactie snelheidsconstanten voor absorptie en desorptie

We benadrukken dat het positieve aspect van deze methodiek is de mogelijkheid om individuele adsorptions observeren op de single-molecule-niveau. De single-molecule metingen van eiwit-adsorptie op een anorganisch oppervlak kan worden opgeschaald door het gebruik van parallelle reeksen van solid-state nanoporiën. De parallelle reeks van nanoporiën is nodig omdat de noodzaak voor het testen van vele poriën op een betrouwbare statistiek te krijgens. Daartoe zou het gebruik van een nanogaatje reeks de bewaking van de individuele adsorptions evenals het meten van meerdere gebeurtenissen voor verdere analyse. Een reeks van nanoporiën in silicium nitride kan gevormd worden door de bovengenoemde protocol gewoon door het boren van meerdere gaten in het monster. Elke nanogaatje moet van vergelijkbare grootte. Arrays van nanoporiën van 6x6 of 7x7 moet voldoende zijn. Na toevoeging van eiwitten analyt in de kamer, zal de huidige verval in een exponentiële wijze, met een volgende expressie:

Ik heb _t = _∞ I - (I _∞ - I ₀₎ exp (-k 't)

Hier, ik _t, geeft de stroom bij een experimenteel tijdstip t. I ₀ is de oorspronkelijke stroom die door de nanogaatje array. Ik _∞ geeft het huidige niveau bij verzadiging (dwz oneindig). K 'is de schijnbare eerste orde reactiesnelheid een constante, die kan worden bepaald uit ee pasvorm van de experimentele curve. Een grotere k 'kan worden geïnterpreteerd als een snellere adsorptie tarief. De verhouding I _∞ / I _0, ook wel de genormaliseerde verzadigingsstroom, is een dimensieloos getal tussen 0 en 1. Deze parameter is een maat voor de bezetting door de geadsorbeerde eiwit analyten. Daarom moet elk afzonderlijk experimentele conditie worden geassocieerd met twee specifieke output-parameters I _∞ / I ₀ en k '.

Opgemerkt moet worden dat de schijnbare eerste orde adsorptie snelheidsconstanten en genormaliseerd stromen worden beïnvloed door de effectieve tijd die eiwitten binnen de nanoporiën. Deze tijd is afhankelijk van de concentratie van het eiwit analyten in bulk waterige fase ^24. Daarom is extra correctie van deze nummers dient te worden uitgevoerd op basis van de effectieve tijd die besteed door de eiwitten in de nanogaatje interieur. Wij stellen voor het meten van de frequentie van de fast (translocatie) evenementen en te vermenigvuldigen met de gemiddelde verblijftijd van dergelijke gebeurtenissen. Dit geeft de gemiddelde tijd van de eiwitten besteed binnen de nanogaatje interieur per tijdseenheid.

De snelheidsconstante van desorptie kan worden bepaald met behulp van een parallelle reeks van nanoporiën ook. Zodra het huidige niveau verzadiging (I _∞) bereikt, de spanning moet worden omgedraaid, zodat er geen meer eiwitten zitten gevangen in de nanoporiën. Desorptie van de afzonderlijke eiwitten zal gepaard gaan met de wijziging van de opgenomen stroom naar hogere waarden. Het tarief constant wordt dan uit de stijging van het huidige niveau.

5.2 De Langmuir adsorptie constante

De absorptie van proteïne analyten op de anorganische oppervlakken van de nanoporiën is afhankelijk van de eiwit concentratie in waterige fase. Dit fenomeen is al waargenomen bij de single-molecule level ^13. Als θ vertegenwoordigen s de genormaliseerde verzadiging stroom (I _∞ / I _0), dan is een typisch Langmuir isotherm vergelijking wordt gegeven door de volgende uitdrukking:

waar C is het eiwit concentratie in de waterfase. α is de Langmuir adsorptie constant. Deze constante neemt toe met een toename in de bindingsenergie van adsorptie en met een daling van de temperatuur. De verzameling van de gegevens θ punten zal door metingen met een parallel-arrays uit bij verschillende eiwit-concentraties in waterige fase uitgevoerd. De gegevens moeten worden geanalyseerd in combinatie met andere technieken om de omvang van de aangebrachte Langmuir adsorptie constant te controleren. Daarnaast kunnen full-atomistische moleculaire dynamica simulaties ^25,26 ook gebruikt worden om de interpretaties van de verkregen experimentele gegevens te helpen.

titel "> 6. representatieve resultaten

Typische resultaten voor solid-state nanoporiën zijn als volgt. De open poriën huidige moet zeer stabiel zijn, zoals te zien in Fig. 4a. De I / V kenmerken van de nanogaatje moet zeer lineair in 1 M KCl, 10 kalium-fosfaat, pH 7,4, zoals te zien in Fig. 2. De helling van een lineaire fit aan de I / V-curve zal de unitaire geleiding van de nanogaatje. De geleiding heeft een directe relatie met de nanogaatje diameter en moet overeenkomen met de vergelijking: , Waarbij G is de geleiding van de nanogaatje, d is de diameter, l is de lengte, en σ is de geleidbaarheid van de oplossing in de kamer ^14. Deze waarde moet overeenkomen met tot binnen 30%. Als het te klein is, wordt uw poriën waarschijnlijk niet bevochtigd. Met toevoeging van eiwitten, moet een snelle gebeurtenissen volgen, zoals te zien in Fig. 4b. Protein adsorptie is een langlevende huidige daling zoals weergegeven in Fig. 4c. Sommige eiwitten zijn zeer labiel en ondergaan structurele transformatie binnen de porie interieur. In dit geval zal de lange levensduur spanningsval gepaard gaan met snelle schommelingen.

Figuur 1. Solid-state nanogaatje vervaardigd met behulp van een Tecnai F20 S / TEM. De porie was geboord in STEM-modus tot een diameter van 20 nm. Het beeld werd genomen in bright-field TEM-modus. Nitride was 30 nm dik.

Figuur 2. Kamer wordt gebruikt voor woningbouw een solid-state nanoporie in resistieve-pulse metingen. A) kamer en een silicium chip met vrijstaande nitride venster (TEM grid). De nanogaatje is geboord in het nitride voorafgaand aan het laden. Rode O-ringen worden gebruikt om een ​​goede s vormpaling over de chip, die twee baden van ionische oplossing scheidt. B) Schema van de kamer laten zien plaatsing van de oplossing baden en elektroden met betrekking tot de nanogaatje.

Figuur 3. Typische I / V sporen voor solid-state nanoporiën van verschillende diameters. Single-channel elektrische sporen werden genomen in 1 M KCl, 20 mM Tris, pH 8,5. Nanoporiën werden geboord in 30 nm dik silicium nitride. Opmerking nitride dikte van invloed op de unitaire geleiding van de nanogaatje.

Figuur 4. Gemeten single-channel de huidige sporen en de detectie van eiwit adsorptie. A) is een single-channel elektrische trace met de open stroom van een 10 nm diameter nanogaatje. B) Huidige doorbuiging vertegenwoordigen compartimentering van de bovine serum albumine (BSA) in de interior van de nanogaatje. C) Adsorptie van BSA op het nitride oppervlak. Alle sporen zijn van dezelfde nanogaatje in 1 M KCl, 10 mM kalium-fosfaat, pH 7,4. De toegepaste transmembraan potentiaal werd +40 mV en de BSA werd toegevoegd aan de geaarde kamer bad bij een concentratie van 120 nM.

Discussie

Spontane adsorptie van eiwitten op solid-state oppervlakken ^27-29 is van fundamenteel belang in een aantal gebieden, zoals de biochip toepassingen en het ontwerp van een nieuwe klasse van functionele hybride biomaterialen. Eerdere studies hebben aangetoond dat eiwitten geadsorbeerd aan solid-state oppervlakken geen laterale mobiliteit of significante desorptie-tarief is gebleken, en daarom eiwit-adsorptie wordt algemeen beschouwd als een onomkeerbaar en niet-specifieke proces van ^30-32. Eiwitadsorp...

Materialen

Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties
Tecnai F20 S / TEM	FEI		S / TEM vereist acceleratie spanning ≥ 200kV en veld-emissie bron.
20 nm dik siliciumnitride membraan venster voor TEM	SPI	4163SN-BA
Axon Axopatch 200B patch-clamp versterker	Molecular Devices
Axon Digidata 1440A	Molecular Devices
pCLAMP 10 software	Molecular Devices		Elektrofysiologie data-acquisitie en-analyse software
Zwavelzuur	Fisher Wetenschappelijke	A300
waterstofperoxide	Fisher Scientific	H325
siliconen O-ringen	McMaster-Carr	003 S70	U kunt ook gebruik PDMS
zilverdraad	Sigma-Aldrich	348759	Voor elektroden
SPC Technology, D sub contact, pin	Newark	9K4978	Voor elektroden
kaliumchloride	Sigma	P9541
kalium Dibasisch	Sigma	P2222
kalium monobasisch	Sigma	P5379
PDMS	Dow Corning		Sylgar 184 Elastomer set. Voor het maken van kamer.
Kwik-Cast Sealant	Wereld precisie-instrumenten	KWIK-CAST	Snelwerkend siliconenkit
kookplaat	Fisher Scientific
Kooi van Faraday