Stamceltransplantatie in een In vitro Gesimuleerde ischemie / reperfusie model

Samenvatting

Laten we zien hoe het opzetten van een In vitro Ischemie / reperfusie model en hoe het effect van de stamceltherapie op postischemic cardiale cellen te evalueren.

Samenvatting

Stamceltransplantatie protocollen vinden hun weg naar de klinische praktijk ^1,2,3. Beter resultaat, waardoor de protocollen robuuster, en het vinden van nieuwe bronnen voor de implanteerbare cellen zijn de focus van recent onderzoek ^4,5. Onderzoek naar de effectiviteit van de cel therapieën is niet een gemakkelijke taak en zijn nieuwe instrumenten nodig om de mechanismen betrokken bij het ​​behandelingsproces ^zes onderzoeken. We ontwierpen een experimenteel protocol van ischemie / reperfusie in om het observeren van cellulaire verbindingen en zelfs subcellulaire mechanismen tijdens ischemie / reperfusie schade en na stamceltransplantatie mogelijk te maken en de effectiviteit van celtherapie te evalueren. H9c2 cardiomyoblast cellen werden geplaatst op celcultuur platen ^7,8. Ischemie werd gesimuleerd met 150 minuten in een glucose-vrij medium met zuurstof niveau lager dan 0,5%. Daarna werden de normale media en zuurstof niveaus opnieuw naar reperfusie te simuleren. Na zuurstof glucose ontbering,de beschadigde cellen werden behandeld met de transplantatie van gelabelde menselijke beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen toe te voegen aan de cultuur. Mesenchymale stamcellen de voorkeur in klinische studies, omdat ze gemakkelijk te bereiken met minimaal invasieve chirurgie, gemakkelijk uitbreidbaar en autologe. Na 24 uur co-teelt, werden cellen gekleurd met calceïne en ethidium-homodimeer onderscheid te maken tussen levende en dode cellen. Deze opzet liet ons toe om de intercellulaire verbindingen met behulp van confocale fluorescentie microscopie te onderzoeken en om de overleving van postischemic cellen door flowcytometrie kwantificeren. Confocale microscopie toonde de interacties van de twee celpopulaties zoals celfusie en de vorming van intercellulaire nanobuisjes. Flowcytometrie analyse bleek drie clusters van beschadigde cellen die kunnen worden uitgezet in een grafiek en statistisch geanalyseerd. Deze populatie kunnen afzonderlijk worden onderzocht en conclusies kunnen worden getrokken over deze gegevens over de effectiviteit van de gesimuleerdetherapeutische aanpak.

Protocol

1. Voorbereiden H9c2 cardiomyoblast cellen

H9c2 rat cardiomyoblasts werden verkregen van ATCC (Wesel, Duitsland) en uitgebreid in hoge glucose (4,5 g / L) DMEM dat 10% foetaal runderserum, 4 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine. De H9c2 myoblast cellijn is afkomstig van embryonale rat hart, wordt het gebruikt als een in vitro model voor zowel de skelet-en hartspier ^8,9.

Bereid 12 well plaat van H9c2 cellen:

1. Verwijder kweekmedium uit petrischaal van H9c2 cellen.
2. Twee keer wassen cellen met 5 ml PBS en verteren met 2-3 ml 0,05% trypsine / EDTA.
....

Discussie

De aangetoonde protocol is een in vitro benadering van de veel meer complexe kwestie van stamceltherapie in myocard infarct, met alle voordelen en nadelen van een dergelijk model. Uiteraard kan het geen afspiegeling van het complex (bijvoorbeeld immunologische) evenementen die plaatsvinden tijdens en na het hartinfarct, maar kan zich richten op de directe effecten van de toegevoegde cellen op het postischemic cellen. De effecten van gesimuleerde ischemie op H9c2 cardiomyoblasts sterk afhankelijk van het tijdstip van OGD.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties
calceïne-AM	Molecular Probes	L3224, C3099	http://www.invitrogen.com
ethidium homodimeer-2	Molecular Probes	L3224, E3599	http://www.invitrogen.com
Vybrant DiD	Molecular Probes	V22887	http://www.invitrogen.com

Tabel 1. Reagentia.

Naam van het apparaat	Vennootschap	Commentaar (optioneel)
Pecon cel incubatie systeem voor Zeiss microscopen	Pecon GmbH	www.pecon.biz/

Tabel 2. Equipment.