Dissectie en Cultuur van Chick Statoacoustic Ganglion en Spinal Cord Explantaten in Collageen Gels voor neurietuitgroei Assays

Samenvatting

Laten we zien hoe te ontleden en cultuur chick E4 statoacoustic ganglion en E6 ruggenmerg explantaten. Explantaten worden gekweekt onder serum-vrije omstandigheden in 3D collageen gels voor 24 uur. Neurieten responsiviteit is getest met de groei factor-aangevuld medium en met eiwit-gecoate kralen.

Samenvatting

De zintuigen van de kip binnenoor worden geïnnerveerd door de perifere processen van statoacoustic ganglion (SAG) neuronen. Zintuig innervatie is afhankelijk van een combinatie van een axon begeleiding signalen ¹ en ² survival factoren gelegen langs het traject van de groeiende axonen en / of binnen hun zintuig doelen. Bijvoorbeeld, functionele interferentie met een klassieke axon begeleiding signaalweg, semaphorin-neuropilin, gegenereerd misrouting van otic axonen ^3. Ook verschillende groeifactoren, uitgedrukt in de sensorische doelstellingen van het binnenoor, waaronder neurotrofine-3 (NT-3) en Brain afgeleide neurotrofe factor (BDNF), zijn gemanipuleerd in transgene dieren, weer wat leidt tot misrouting van SAG axonen ^4. Deze zelfde moleculen bevorderen, zowel overleving en uitgroei van neurieten van kuiken SAG neuronen in vitro ^5,6.

We beschrijven hier en demonstreren van de in-vitro-methode die wij op dit moment are uzingen voor de responsiviteit van kuiken SAG neurieten test om oplosbare eiwitten, waaronder bekende morphogens zoals de Wnts, evenals de groei factoren die van belang zijn voor het bevorderen van SAG neurietuitgroei en neuron overleven. Met behulp van dit model systeem, hopen we conclusies over de effecten die uitgescheiden liganden kunnen uitoefenen op de SAG neuron overleving en neurietuitgroei trekken.

SAG explantaten worden ontleed op embryonale dag 4 (E4) en gekweekt in drie-dimensionale collageen gels onder serum-vrije omstandigheden gedurende 24 uur. Ten eerste is neurieten reactievermogen getest door het kweken van explantaten met eiwit-aangevuld medium. Dan, om te vragen of puntbronnen van uitgescheiden liganden kunnen directionele effecten op neurietuitgroei hebben, zijn explantaten samen gekweekt met eiwit-gecoate kralen en getest op het vermogen van de kraal om lokaal bevorderen of belemmeren uitgroei. We hebben ook een demonstratie van de dissectie (gewijzigde protocol ⁷⁾ en de cultuur van E6 ruggenmerg explantaten. Wijroutinematig gebruik van het ruggenmerg explantaten op bioactiviteit van de eiwitten en eiwit-doordrenkte kralen te bevestigen en te controleren soort cross-reactiviteit met chick weefsel, onder dezelfde voorwaarden als de cultuur SAG explantaten. Deze in vitro testen zijn handig voor het snel screenen op moleculen die trofische (overleving) of tropische (directionele) effecten op de SAG neuronen uit te oefenen, vooral vóór het uitvoeren van studies in vivo. Bovendien is deze methode maakt het testen van individuele moleculen onder serum-vrije omstandigheden, met een hoge neuron overleven ^8.

Protocol

Recepten

Chick Ringers

7,2 g	NaCl
0,23 g	CaCl 2 + 2H 2 O
0,37 g	KCl
0,115 g	Na 2 HPO 4
900 ml	Water (weefselkweek graad)

Opmerking: Breng de pH tot 7,4. Breng uiteindelijke volume tot 1000 ml met water.

10X PBS

40 g	NaCl
1 g	KCl
7 g	Na 2 HPO 4
1,2 g	KH 2 PO 4
450 ml	DEPC water

Opmerking: Breng de pH tot 7,4. Breng finalevolume tot 500 ml met water. Werken concentratie (1X) wordt gemaakt door het verdunnen van een deel 10X voorraad met 9 delen van weefsel-cultuur kwaliteit water, zoals die verkregen met een Millipore UV-bestraling systeem om water te genereren met 18 MΩ cm geleidbaarheid.

SAG explantatie holding medium

• DMEM/F12 met L-glutamine, 10 mM Hepes
• 10% Insuline, overdragen, Selenium (ITS +1)
• 1% pen-strep

Explantatie kweekmedium

• SAG explantatie holding medium
• 10 ng / ml neurotrofine-3 (NT-3)
• 10 ng / ml ciliaire neurotrofe factor (CNTF)

Ruggenmerg dissectie en het bedrijf medium

• L-15
• 10% foetaal kalf serum
• 1% pen-strep

Incubeer de eieren bij 37-38 ° C. Steriliseren ontleden gereedschappen en Sylgard ontleden schotel in 70% ethanol. Ontleden gerechten en tools kunnen ook worden 's nachts UV gesteriliseerd.

1. Bead voorbereiding

1. Plaats kralen in een microbuisjes met 1 ml steriele PBS, mix, en wacht tot de kralen om zich te vestigen op de bodem van de buis.
2. Was de kralen meerdere malen door het verwijderen van het supernatant na de kralen hebben gevestigd en resuspendeer in PBS.
3. Incubeer de kralen in gezuiverde eiwit (verdund in PBS) of PBS alleen (Control) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
4. Spoel de kralen in PBS en bewaar in een 24-wells plaat met 1 ml PBS totdat geplaatst in collageen.

2. Statoacoustic ganglion dissectie

1. Op E4 verwijder het embryo uit het ei en plaats deze in een schaal met de oplossing chick Ringer om embryonale membranen te verwijderen.
2. Plaats het embryo in een Sylgard © bekleed petrischaal gevuld met koud HBSS en positie van het embryo op zijn kant met de otic blaasje naar boven. Speld de embryo de schaal met behulp ontleden pinnen.
3. Met behulp van twee ontleden pinnen, een horizontale snede te maken door de huid onmiddellijk aan de ventralekanaal zakken, ongeveer waar het voldoet aan het cochleair kanaal. Maak een verticale snede voorste en achterste naar de SAG. Gebruik een tang of een dissectie pin op te tillen en verwijder de klep van de huid begrensd door de drie bezuinigingen.

   Opmerking: De SAG is gelegen aan de rand van de anteroventral otocyst, ongeveer halverwege tussen de dorsale pouch die gemakkelijk zichtbaar met helderveld basis verlichting, en de ventrale cochleaire kanaal die ventromedially projecten en wordt verduisterd door de faryngeale bogen. Het cochleair kanaal verlengt zodat de dorsoventral dimensie stijgt geleidelijk op E4 tussen Hamburger-Hamilton stadia 23 tot 25 september.

4. Trek de otocyst in een posterieure richting om het te scheiden van de SAG. Verplaats weefsel rondom de SAG met de dissectie pinnen en voorzichtig de SAG te verwijderen uit het embryo met behulp van # 55 tang. Verwijder de grote stukken van mesenchymale weefsel en uitstekende zenuwbanen van de SAG.
5. Met behulp van een brede mond pipet tip, overdracht van de explantatie naar een24-wells plaat met 0,5 ml SAG explant holding medium. Houden explanten op ijs of op kamertemperatuur voor maximaal 4 uur.

3. Ruggenmerg dissectie

1. Verwijder de E6 embryo uit het ei en plaats deze in een schotel met kuiken Ringer-oplossing. Verwijder de kop en embryonale membranen.
2. Plaats het lichaam in een Sylgard © dissectie schotel met koud ruggenmerg dissectie medium. Positie en pin het embryo "ventrale down" en caudale tegenover de experimentator. Plaats ontleden pinnen door elk ledemaat en door het voorste einde.
3. Met behulp van een tang en / of ontleden van pennen, verwijder voorzichtig de huid en weefsel, het verplaatsen in een ventrale richting, tot aan de dorsale oppervlak van het ruggenmerg zichtbaar is.
4. Snijd de dorsale middellijn van het ruggenmerg met een dissectie pin, in een posterior naar anterior richting, langs de gehele lengte van het ruggenmerg. Dit leidt tot een "open boek" als de linker-en rechterkant van het ruggenmerg te scheiden.
5. Verwijder het omringende weefsel, zijwaarts, naar het ruggenmerg te isoleren en bloot achterwortelganglia (DRG). Verwijder de DRG en de hersenvliezen door wrijven een dissectie pin of pincet tussen het ruggenmerg en de DRG.
6. Verwijder het ruggenmerg uit het lichaam door die het meest caudale uiteinde van het ruggenmerg met een tang en omhoog en weg van de experimentator. Verwijder de resterende DRG en hersenvliezen.
7. Houd een uiteinde van de het ruggenmerg met een pincet (of pin aan de schotel) en gebruik Vannas schaar te snijden langs de ventrale middellijn, aan het ruggenmerg halveren.
8. Houd een uiteinde van de explantatie met een tang om het weefsel te immobiliseren en gebruiken Vannas schaar om kleine explantaten (100-500 um in lengte) afgesneden langs de lengte van het weefsel. De vloerplaat kan worden herkend als een duidelijke verdikking van weefsel langs een explantatie rand.
9. Gebruik een brede mond pipet tip om explantaten over te dragen aan een 24 wells plaat met 0,5 ml koud dissectie medium. Houden explantaten op ijs te levensvatbaarheid van het weefsel, f onderhoudenof maximaal 4 uur.

4. Explantatie cultuur met gezuiverde eiwitten om neurieten reactiesnelheid te testen

1. Bereid een 1,5 mg / ml collageen oplossing in een 15 ml conische tube, op ijs, volgens de instructies van de fabrikant.
2. Controleer de collageen-oplossing heeft een pH van 7-7,4 het gebruik van pH-indicator papier. Stel de pH door toevoeging van NaOH in een ul volumes.
3. Transfer explantaten een 24-wells plaat met behulp van een brede mond pipet tip en zuig overtollige vloeistof. Meerdere explanten kunnen worden gekweekt in een goed, maar moet worden geplaatst van ten minste 500 micrometer uit elkaar.
4. Voeg 0,5 ml van collageen aan het putje met de explantatie. Plaats de explantaat op de bodem van de put. Zorg ervoor dat elke cultuur volledig set voordat u verder gaat met de volgende goed, omdat de collageen zal beginnen te polymeriseren bij kamertemperatuur.
5. Plaats de petrischaal op een 37 ° C slide warmer gedurende 30-45 minuten naar het collageen polymeriseren. Wanneer het collageen is polymegoedkeuring gegeven voor het zal een gel lijken.
6. Voeg 0,5 ml warm explantatie kweekmedium aangevuld met ofwel gezuiverde eiwitten (verdund in PBS) of PBS (Control) en incubeer bij 37 ° C, 5% CO _2. Effecten op neurietuitgroei zichtbaar moet zijn met 24 uur.

   LET OP: Wij hebben hetzelfde protocol om de cultuur SAG explantaten tot 42 uur.

5. Explantatie co-cultuur met eiwit-gecoate kralen om directionele neurietuitgroei-test

1. Begin met explant cultuur stappen 4.1 tot 4.4.
2. Met behulp van een pipet, transfer 1-5 kralen uit PBS naar de bron die de collageen oplossing en explantatie.
3. Gebruik een tang om kralen 50 tot 500 micrometer positie van de rand van de explantatie.
4. Plaats de plaat op een 37 ° C slide warmer gedurende 30-45 minuten naar het collageen polymeriseren. Het weefsel of kralen kunnen worden verplaatst als het collageen polymeriseert. Controleer de culturen en herpositioneren het weefsel en kralen tijdens de eerste 5 minuten.
5. Voeg 0,5 ml SAG media aan elke well en incubeer gedurende 24 uur.

6. Visualisatie van neurietuitgroei door immunohistochemie

1. Spoel culturen in PBS en vast gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in 4% paraformaldehyde in PBS.
2. Laat de gels van de muren van de putten door het opsporen van rond de rand van de gels met het afgeronde einde van een teflon micro-spatel. Voer de immunostain met de gels in de putten. Spoel verschillende keren in PBS.
3. Incubeer in 0,5 ml blokkeren oplossing (10% kalfsserum, 0,1% Triton X-100, 0,1% natriumazide in PBS) overnacht bij 4 ° C.
4. 'S nachts Incubeer in 0,5 ml primaire antilichaam (anti-β-tubuline antilichaam verdund 1:500 in het blokkeren oplossing) bij 4 ° C.
5. Spoel verschillende keren in PBS. 'S nachts Incubeer in 0,5 ml secundair antilichaam (Alexa fluor 488 geit anti-muis IgG _2b antilichaam verdund 1:500) bij 4 ° C. Vanaf deze stap voorwaarts, houd platen in donkere of wikkel in folie, vanwege de gevoeligheid van het lichtsecundaire antilichamen.
6. Spoel verschillende keren in PBS en bewaar bij 4 ° C in PBS voor maximaal een week.

7. Representatieve resultaten

Figuur 1. Representatieve resultaten van de neurieten-bevorderende effecten van gezuiverd NT-3 en NT-3-gecoate kralen op E4 chick SAG explantaten. SAG neuron cellichamen en neurieten waren immunostained met β-tubuline en afgebeeld met een 10x objectief op een confocale microscoop. Na 24 uur in vitro, SAG explantaten weergegeven grotere neurietuitgroei in de aanwezigheid van 100 ng / ml gezuiverd humaan NT-3 toegevoegd aan het celkweekmedium (1B), in vergelijking met controles (1A). SAG neuronen werden samen gekweekt met kralen geweekte in100 ng / ml NT-3 aan te tonen dat een puntbron van NT-3 ter plaatse kan neurietuitgroei te bevorderen. Explantaten weergegeven langer en dichter neurietuitgroei aan de kant van deExplantatie geconfronteerd met de hiel in vergelijking met de andere kant (1D) en vergeleken met culturen met kralen gedrenkt in PBS (1C) te controleren. Schaalbalk = 200 micrometer.

Figuur 2. Representatieve resultaten van de neurieten-bevorderende effecten van gezuiverd Wnt5a en Wnt5a gecoate kralen op E6 chick ruggenmerg. Ruggenmerg explantaten waren immunostained met β-tubuline en afgebeeld met een confocale microscoop. Na 24 uur van de groei in de aanwezigheid van gezuiverd muis Wnt5a (400ng/ml), neurietuitgroei van Chick ruggenmerg explantaten werd verhoogd (2B) in vergelijking met controles gekweekt zonder Wnt5a (2A). Kralen gedrenkt in 500 ng / ml Wnt5a, 300-500 urn geplaatst vanaf de rand van het ruggenmerg explantaten, ook bevorderd neurietuitgroei (2D) in vergelijking met culturen (2C) controle. Vergelijkbare co-cultuur resultaten werden eerder gepubliceerd met Wnt5a-expressie brengende cellen ^8. Schaalbalk = 200urn.

Discussie

Wij presenteren een methode te ontleden en cultuur E4 SAG en E6 ruggenmerg explantaten, van kuiken, onder serum-vrije omstandigheden. Deze procedure wordt momenteel gebruikt in ons lab aan de gevolgen van de verschillende afgescheiden liganden op SAG neuron overleving en neurietuitgroei studie. Nieuwe aspecten van dit protocol zijn het gebruik van een serum-vrij systeem voor het kweken van explantaten en het gebruik van kralen gedrenkt in groeifactoren de effecten op de SAG neurietuitgroei te bestuderen. Een kraal metho...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagens	Vennootschap	Catalogus nummer	Commentaar
Uitrusting
Dissection microscoop			We maken gebruik van een Leica M80 stereomicroscoop met helderveld verlichting basis
Slide warmer	CS & E.		Collageen polymerisatie
Kip ei-incubator
37 ° C / 5% CO 2 bevochtigde celkweek incubator
Dissection Materialen
Sylgard &kopiëren; gecoat petrischaal
24-well celkweek plaat	Corning	3526
# 5 Dumont tang	Fine Science Tools	11252-30
# 55 Dumont tang	Fine Science Tools	11295-51
Roestvrij staal ontleden pinnen	Fine Science Tools	26002-10	Embryo pinning, fijne dissectie
Moria geperforeerde lepel	Fine Science Tools	10370-17	Embryo oogst / transfer
200 ul brede mond pipetpunten	Dot Scientific Inc	118-96R	Explantatie overdracht
E4 en E6 kippeneieren			& Nbsp;
Chick Ringer-oplossing			Embryo oogst
HBSS	Sigma	H8264	SAG dissectie
L15 medium	Sigma	L5520	Ruggenmerg dissectie medium
Foetaal kalf serum	Atlanta Biologicals	S11150	Ruggenmerg dissectie medium
Vannas Schaar	Wereld precisie-instrumenten	501778	Ruggenmerg dissectie
Collageen voorbereiding
Rat-tail collageen Type I	BD Biosciences	354249	Explantatie cultuur
10X PBS (steriel)			Te neutralize collageen
1N NaOH (steriel)			Te neutraliseren collageen
Gedistilleerd water (steriel)			Te neutraliseren collageen
pH-indicator papers (6.0-8.1)	Whatman papier	2629-990	Om te controleren collageen pH-waarde
15 ml conische buizen	Dot Scientific Inc	818-PG
500 pi brede mond pipetpunten	Dot Scientific Inc	119-R100	Om pipet collageen
Explantatie cultuur
DMEM/F12 medium	Sigma	D8437	Explantatie kweekmedium
ITS +1	Sigma	I2521	Medium aan te vullen
Penicilline-streptomycine	Invitrogen	15140-122	Medium aan te vullen
CNTF (rat)	Sigma	C3835	Medium aan te vullen
NT-3 (menselijke)	Sigma	N1905	Medium aan te vullen
Gezuiverd muis Wnt5a	R & D Systems	645-WN-010
Affi-gel Blue gel kralen	Bio-Rad	153-7302
Immunohistochemie
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Bevestiging
PBS			Spoelt
Triton X-100	Sigma	T9284	Blockingbuffer
Natriumazide	Sigma	S8032	Blockingbuffer
Kalfsserum	Invitrogen	16170-078	Blockingbuffer
Muizen monoklonaal IgG2b anti-β tubuline 1 + II antilichaam	Sigma	T8535	Labels cellichamen en neurieten
Alexa fluor 488 geit anti-muis antilichaam IgG2 b	Invitrogen	A21141	Detecteert β tubuline antilichaam
Teflon micro spatel	VWR	57949-033	Laat collageen gels van goed