$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Isoleren Adipose-stamcellen (ASC)
Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.
- Isoleer rat perirenal en epididymis vet en wassen met een gebufferde zoutoplossing steriele Hank's (HBSS) met 1% foetaal bovine serum (FBS) zoals eerder beschreven 6.
- Gehakt het weefsel en breng 1-2 g in 25 ml HBSS met 1% FBS in een 50 ml buis en centrifugeer bij 500 g gedurende 8 min bij kamertemperatuur.
- Verzamelen de vrij zwevende vetweefsel laag overdracht 125 ml erlenmeyer en 25 ml collagenase type II (200 U / ml) in HBSS gedurende 45 min bij 37 ° C te behandelen op een schudapparaat (125 rpm).
- Verwijder de vloeibare fractie (onder olie en vetlaag) en zuig achtereenvolgens 100-um en 70-um nylon zeef. Centrifugeer het filtraat bij 500 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur zuig de supernatant en tweemaal wassen met 25 ml pellet HBSS.
- Resuspendeer de celpellet in 50 ml kweekmedium (MesenPRO RS basismedium) aangevuld met MesenPRO RS groeisupplement, antibiotica antimycotische (100 U / ml penicilline G 100 ug / mL streptomycine sulfaat en 0,25 ug / ml amfotericine B) en 2 mM L-glutamine en pipet cellen in 2 T75 kolf (25 ml / kolf).
- Cultuur de ASC in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C (passage 2-4 ASC worden gebruikt voor alle experimenten).
2. Voorbereiden Chitosan microsferen (CSM)
Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.
- CSM worden bereid door een water-in-olie emulsies proces met een ionisch gelering waarbij gebruik onze eerdere protocol 6. Emulgeren van een waterige oplossing van chitosan (6 ml van 3% w / v chitosan in 0,5 M azijnzuur) in een 100 ml van een oliefase mengsel van sojaolie, n-octanol (1:2 v / v) en 5% sorbitan-mono-oleaat (span 80) emulgator met overhead (1700 rpm) en magnetische roerstaaf (1000 rpm) tegelijkertijd in tegengestelde richting. Deze dubbele mengmethode zorgt ervoor dat micellen vroeg voor verknoping optreedt gevormd kunnen in oplossing blijven en niet naar de bodem. Bovendien is de magnetische roerstaaf helpt bij het de-aggregatie van chitosan tijdens micel vorming en rigidization.
- Het mengsel wordt constant geroerd gedurende ongeveer 1 uur tot een stabiele water-in-olie emulsie wordt verkregen. Ionische verknoping wordt gestart door de toevoeging van 1,5 ml 1% w / v kaliumhydroxide in n-octanol elke 15 min wordt 4 h (24 ml totaal).
- Na voltooiing van de verknopingsreactie langzaam bezinken de oliefase van het mengsel dat CSM onmiddellijk de bollen op 100 ml aceton. Was de bollen met aceton tot aan de olie-fase wordt volledig verwijderd.
- Droog de herstelde bollen in een vacuüm exsiccator en analeyze zonder verdere verwerking. De gemiddelde deeltjesgrootte CSM, oppervlakte milligram en de toestel kubieke volume werd bepaald met deeltjesgrootte-analysator.
- Voor verdere experimenten was CSM driemaal met steriel water om residueel zouten te verwijderen en absolute alcohol steriliseren.
3. Bepalen van het aantal vrije aminogroepen in CSM
Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.
- Bepaal het aantal vrije aminogroepen in CSM na ionische verknoping met de trinitro benzeensulfonzuur (TNBS) zuur assay van Bubins en Ofner 7. Incubeer 5 mg microsferen met 1 ml 0,5% TNBS oplossing in een 50 ml glazen buis gedurende 4 uur bij 40 ° C en hydrolyseren met de toevoeging van 3 ml 6N HCl bij 60 ° C gedurende 2 uur.
- Koel de monsters tot kamertemperatuur en extraheren van de vrije TNBS door toevoeging van 5 ml gedeioniseerd water en 10 ml ethylether.
- Verwarm een 5 ml aliquot van de waterfase tot 40 ° C in een waterbad gedurende 15 minuten om eventuele ether, afkoelen tot kamertemperatuur, verdampen en verdund met 15 ml water.
- Meet de absorptie bij 345 nm met een spectrofotometer TNBS oplossing zonder chitosan als blanco en chitosan voor CSM preparaat in de totale aantal aminogroepen bepalen. Schatting van het aantal vrije aminogroepen van de CSM ten opzichte van chitosan.
4. Laden ASC in CSM
Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.
- Equilibreer 5 mg gesteriliseerd CSM uit paragraaf 2.5 in steriele HBSS 's nachts en toe te voegen aan een 8-um poriegrootte membraan cultuur plaat insert (24-wells plaat).
- Nadat de CSM hebben zich op het membraan voorzichtig zuig de HBSS en voeg 300 ul groeimedium aan de binnenzijde van het inzetstuk en 700 ul van groeimedia met the buitenkant van de insert.
- Hersuspenderen ASC de juiste concentratie (1 x 10 4 4 x 10 4) in 200 pi groeimedium en zaad via CSM in de petrischaal inzetstuk. Het eindvolume van medium in de cultuur inzetstuk, na het zaaien, 500 ul.
- Incubeer de ASC geplaatste CSM gedurende 24 uur in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.
5. Bepalen van het percentage van de ASC laden en levensvatbaarheid van de cellen in CSM
Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.
- Na de incubatie, het verzamelen van de ASC-loaded CSM in een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis zonder verstoring van de cellen die zijn gemigreerd naar de insert membraan.
- Verwijder het resterende medium en voeg 250 ul vers groeimedium de buis.
- Om elke buis voeg 25 ul MTT (3 - [4,5-dimethylthiozole-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide bromide]oplossing (5 mg / ml) en incubeer 4 h in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.
- Na incubatie verwijderen medium, voeg 250 ul dimethyl sulfoxide en vortex het mengsel gedurende 2-5 minuten de formazan complex oplosbaar.
- Centrifugeer de CSM bij 2700 x g gedurende 5 minuten, en bepaal de supernatant absorptie gemeten bij 570 nm met behulp van 630 nm als referentie.
- Bepaal het aantal cellen in verband met de CSM ten opzichte van de extinctie van bekende nummers van levensvatbare ASC.
6. Kenmerkend ASC-CSM-Embedded Collageen Gel
Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.
- Mix ASC geladen CSM (5 mg met ≈ 2 x 10 4 cellen) met type 1 collageen (7,5 mg / ml) uit rattenstaart pees volgens de werkwijze van Bornstein 8 en fibrilleren nadat de pH op 6,8 met 2 N NaOH.
- Voeg de gefibrilleerde collageen ASC-CSM mengsel tot een 12-well plaat en gedurende 30 minuten bij een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.
- Na volledige fibrillatie incuberen de collageen ASC-CSM gels tot 14 dagen in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.
- Afgifte en migratie van cellen uit CSM in de gel waargenomen met behulp van standaard microscopische technieken.
7. Representatieve resultaten
In de huidige studie hebben we een in vitro strategie om stamcellen van chitosan microsferen (CSM) te leveren in een collageen gel schavot. Poreuze CSM van uniforme grootte (175-225 micrometer in diameter) en samenstelling werden bereid en gebruikt als cel dragers (figuur 2). Bij incuberen ASC de CSM de cellen gevoegd in een concentratie van 2 x 10 4 cells/5mg van CSM. De cellen waren in staat om zich over de microsfeer, terwijl de uitbreiding van filopodiain het poreuze spleten van de microsfeer (figuur 3). Wanneer de cel geladen CSM werden gemengd met het collageen gel, de cellen onmiddellijk begonnen migreren naar de gels (figuur 4).
Tabel 1. Biologische voordelen voor het gebruik van chitosan en collageen in een stamcel leveringssysteem.
Figuur 1. Schematische afbeelding van de algemene strategie voor de dubbel gebruik van de ASC-CSM geladen collageen steigers. Figuren 2, 3 en 4 zijn geannoteerd in het schema om te helpen met de interpretatie van de beelden.
Figuur 2. Schematische weergave afgebeeld het proces zaaien stamcellen op chitosan microsferen. De process gaat co-kweken van ASC met CSM in een 8 - um poriegrootte membraan cultuur plaat insert. Na 24 uur worden de microsferen uit de insert en klaar voor het inbedden in een matrix biomateriaal.
Figuur 3. Morfologische karakterisatie van CSM-geladen met ASC. Paneel A toont een licht microfoto van ASC-loaded CSM, terwijl paneel B toont hetzelfde beeldveld bovenop met een beeld verkregen door confocale fluorescentie microscopie. ASC werden geleverd met calceïne AM (groen). Paneel C toont een beeld van een SEM-opname van een onbelaste microsfeer, terwijl het paneel D toont cellen geladen op de microsfeer (sterretjes). De TEM beeld paneel E toont een dwarsdoorsnede van een onbelaste microsfeer. Een veelheid van poriën en spleten liggen verspreid over het microsfeer. Paneel F toont een doorsnede-doorsnede microsfeer met cellen (pijlen) verbonden en verlenging filopodia de creondeugden. Originele vergrotingen: A & B = 70X, C = 500x, D = 2.000 x, E & F = 2.500 x.
Figuur 4. Migratie van ASC de CSM de driedimensionale collageen scaffold. Panelen A en B tonen de CSM met cellen migreren uit de buurt van microsfeer en in de collageen matrix op dag 3 (A, pijlen). Paneel B toont een soortgelijk cultuur na 12 dagen. Transmissie electronenmicroscopie (TEM) beelden worden weergegeven in C, D en E. Asterisks in C en D tonen een microsfeer die cross-doorsnede is met cellen migreren afstand van de microsfeer (pijlen). Hogere vergroting van het paneel D is afgebeeld in panel E, en toont cel filopodia aan de collageen fibrillen (inzet). Originele vergroting: A & B = 100x, C & D = 6.000 x, E = 20.000 x, inzet = 150.000 x.
Figuur 5.Schematische afbeelding van de enorme gebruik van CSM in de regeneratieve geneeskunde en drug delivery.