Het beoordelen van de lever metabole veranderingen tijdens Progressieve kolonisatie van Kiemvrije Mouse door 1 H NMR-spectroscopie

Samenvatting

Een progressieve kolonisatie procedure wordt beschreven om nader te beoordelen de impact ervan op de host levermetabolisme. Colonization is gecontroleerd non invasief door het evalueren van de urinaire excretie van microbiële metabolieten door co-NMR-based metabool profiel, terwijl levermetabolisme wordt beoordeeld door de hoge resolutie Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profilering van intact biopsie.

Samenvatting

Het is bekend dat darmbacteriën belangrijke bijdrage leveren aan de host-homeostase en biedt een scala aan voordelen, zoals bescherming van het immuunsysteem en vitamine synthese. Zij verzorgen ook de gastheer met een aanzienlijke hoeveelheid aan voedingsstoffen, waardoor dit ecosysteem een ​​essentiële metabolische orgaan. In de context van steeds meer bewijs van het verband tussen de darmflora en het metabool syndroom, het begrip van de metabole interactie tussen de gastheer en zijn darmflora is steeds een belangrijke uitdaging van de moderne biologie. ^1-4

Kolonisatie (ook wel aangeduid als normalisatie proces) wijst het opzetten van micro-organismen in een voormalige kiem-vrije dieren. Hoewel het een natuurlijk proces optreedt bij de geboorte, wordt het ook gebruikt bij volwassen kiemvrije dieren naar de darm bloemen ecosysteem-controle en verder bepalen de impact ervan op de host stofwisseling. Een gemeenschappelijke procedure om de kolonisatie procesbeheersing is om de maagsonde methode te gebruiken met een single of een mengsel van micro-organismen. Deze methode resulteert in een zeer snelle kolonisatie en presenteert het nadeel van de uiterst stressvolle ^5. Daarom is het nuttig om de stress te minimaliseren en een tragere kolonisatie proces te krijgen geleidelijk houden aan de invloed van bacteriële vestiging op de host stofwisseling.

In dit manuscript beschrijven we een procedure om de wijziging van metabolisme in de lever te beoordelen tijdens een geleidelijke kolonisatie proces met behulp van een niet-destructieve metabool profiel techniek. Wij stellen voor om darm microbiële kolonisatie monitor aan door het beoordelen van de darm microbiële metabolische activiteit weerspiegeld door de urinaire excretie van microbiële co-metabolieten door ^een H NMR-based metabool profiel. Hierdoor kan een appreciatie van de stabiliteit van de darm microbiële activiteit buiten de stal oprichting van de darm microbiële ecosysteem meestal bepaald door het bewaken van fecale bacteriën door DGGE (denaturerende gradiënt gel elektroforese). ⁶ Dekolonisatie vindt plaats in een conventionele open omgeving en wordt geïnitieerd door een vuile nest bevuild door middel van conventionele dieren, die zal dienen als controle. Knaagdieren worden coprophagous dieren, dit zorgt voor een homogene kolonisatie zoals eerder beschreven. ⁷

Hepatische metabool profiel wordt direct gemeten vanaf een intacte lever biopsie met behulp van ^een H met hoge resolutie Magic Angle Spinning NMR spectroscopie. Deze semi-kwantitatieve techniek biedt een snelle manier om te beoordelen, zonder beschadiging van de celstructuur, de belangrijkste metabolieten zoals triglyceriden, glucose en glycogeen om verdere raming van de complexe interactie tussen de kolonisatie proces en het levermetabolisme ^7-10. Deze methode kan ook worden toegepast op elk weefsel biopsie ^11,12.

Protocol

1. Kolonisatie van kiemvrije dieren en monsters verzamelen van

1. Verwijder kiemvrije dieren uit isolatoren en onderbrengen in een conventionele veehouderij kamer in kooien zijn uitgerust met een filter in de voorkant van de gebruikelijke dieren, die zal dienen als controles (figuur 1).
2. Meng de helft van het nest (3 dagen oud) uit de controle-conventionele kooi met het nest van de kiem-vrije dieren. Altijd 1 / 3 van de vuile conventionele nest elke keer is het nodig om het te vernieuwen met het oog op een niveau van bacteriën (houd het in ieder geval voor 3 dagen) te handhaven.
3. Verzamel urine in een 1,5 ml microbuisjes door het hanteren van de muis over de buis en helpen bij mictie door zachtjes masseren de darmen. Snap-vries onmiddellijk in vloeibare stikstof. Bewaar in ieder geval bij -40 ° C tot NMR-analyse. Een minimaal volume van 20 ul is vereist voor het verwerven met een 5 mm NMR probe, maar het wordt aanbevolen om 30 pi te gebruiken om de kwaliteit van het metabool profiel te verbeteren.
4. Dieren moet be gedood zonder gebruik van enig verdoving om confounding NMR resonanties te wijten aan het levermetabolisme van verdoving verbindingen (bijvoorbeeld gebruik cervicale dislocatie gevolgd door een bevestiging van de dood door verbloeding) te vermijden

2. Aanbeveling voor de inzameling van leverbiopsie

1. Gebruik geen producten die alcohol bevatten om besmetting te voorkomen. Was de tools met behulp van water of alleen zoutoplossing.
2. Niet perforeren galblaas. In het geval van gal lekken, onmiddellijk tissue met water of zoutoplossing.
3. Verzamel lever biopten (Ongeveer 15-50 mg) van de linker kwab, zoals aangegeven in figuur 2. Voor reproduceerbare biopten, consequent te verzamelen in het midden van de linker kwab het vermijden van de perifere gebieden waar weefsel wordt dunner.
4. Snap bevriezen biopten in vloeibare stikstof onmiddellijk en bewaar ze bij -80 ° C tot NMR-analyse.

3. ^1H NMR overname van urine microvolume

1. Bereid 0,2 M natriumfosfaat buffer oplossing in D2O (99,8%), pH 7,4 met 1 mM 3 - (trimethylsilyl) propionzuur-d ₄ (TSP).
2. Meng 30 pi van de urine met 30 pi van natrium fosfaat buffer.
3. Overdracht 50 ul van gemengde oplossing in 1,7 mm NMR-capillair (Figuur 3 (2)) met behulp van een 50 il glazen injectiespuit met een metalen naald (OD 0.5 mm). Wees voorzichtig om luchtbellen te vermijden.
4. Monteer de capillaire adapter (Figuur 3 (3)) op de top van de capillaire met urine monster en plaats deze in een 2,5 mm NMR microbuisjes voor 5 mm NMR probe (Figuur 3 (1)). Gebruik deze combinatie van buizen als een gewone 5 mm NMR-buis voor spectrale acquisitie.
5. Gebruik de winning stang (Figuur 3 (4)) om capillair te verwijderen vanaf 2,5 mm NMR-buis door schroeven van de capillaire adapter voorzichtig om het eruit te trekken.

. 4 ¹ H-HR-MAS NMR van leverweefsel biopsie: monstervoorbereiding

1. MAS rotor componenten en tools zijnzoals beschreven in figuur 4.
2. Plaats biopsie (Ongeveer 15-50 mg) in zirkonium rotor (figuur 4) (1) en vul de rest van het volume met zuivere D ₂ O voor NMR slot. Wees voorzichtig om geen enkele belletjes, omdat dit de kwaliteit van de latere vulplaten en de kwaliteit van de data-acquisitie veranderen.
3. Plaats 50 pi Teflon spacer (Figuur 4 (2)) met de cilindervormige schroef (Figuur 4 (5)). Schroef het en kalibreren met behulp van de dieptemeter op de korte zijde (Figuur 4 (8)). In deze stap, is het belangrijk om een ​​specifieke aandacht te besteden aan de steekproef omdat een deel daarvan kan lekken door de spacer gat. Als dit het geval is, dan is een deel van de biopsie wordt vernietigd en het gewicht monster is niet meer betrouwbaar. Het is dus noodzakelijk om opnieuw te beginnen vanaf het begin de voorbereiding van het monster.
4. Plaats de thead pin (Figuur 4 (3)) en voorzichtig schroef met de schroevendraaier (Figuur 4 (6)). Uitdrogen eventueel resterend water met een stukje weefsel.
5. Plaats de dop (Figuur 4 (4)) op detop van de rotor en steek deze in de rotor verpakker (Figuur 4 (6)). Druk stevig totdat de dop op zijn plaats. Er mag geen ruimte tussen de rotor en de dop.
6. Markeer de helft van de onderkant van de rotor met een zwarte marker pen optische spin detectie mogelijk te maken.
7. Plaats de rotor in de NMR-spectrometer en beginnen draaien op 5 kHz. Verwerven ^een H-NMR-spectrum met behulp van CPMG pulssequentie ¹³ volgens de richtlijnen van de fabrikant.
8. Gebruik α anomere glucose resonantie op 5,22 ppm (doublet) om NMR-spectra te kalibreren.
9. Om de rotor uit te pakken, ga dan verder door het verwijderen van de kap met behulp van de dop remover (Figuur 4 (9)). Schroef thead pin en verwijder de Teflon spacer met behulp van de cilindrische schroef. Grondig wassen met water en afwasmiddel.

5. Representatieve resultaten

Gut microbiële activiteit kan worden gecontroleerd met behulp van urine-metabool profiel. Een groot aantal van urine-microbiëleco-metabolieten te herkennen aan ^een H-NMR zijn beschreven in de literatuur ^7,14-17. Deze microbiële co-metabolieten zijn vooral nuttig om de kolonisatie proces te volgen als zij een snelle en niet-invasieve manier om te schatten wanneer de nieuw opgerichte ecosysteem is stabiel. Figuur 5A illustreert duidelijk de verschijning van darm microbiële co-metabolieten over de kolonisatie proces. Deze figuur toont een urine-metabool profiel verkregen door het volgen van de procedure beschreven in stap 2 voor een dier gekoloniseerd 20 dagen met behulp van de procedure beschreven in Stap 1. Dit dier niet uitscheiden geen indoxyl sulfaat en zeer kleine hoeveelheden van phenylacetylglycine (PAG) en p-cresol sulfaat in de kiem-vrije staat (dag 0-blauw). Als kolonisatie vordert, deze 3 markers van proteïne metabolisme door de darmflora aanzienlijk te verhogen tot een evenwicht te bereiken op dag 20 (rood). Dit is gemakkelijk te volgen voor een groep van dieren, zoals geïllustreerd in Figuur 5B het gebruik van de PAGresonantie. Dit diagram werd verkregen door de integratie van de oppervlakte onder de resonanties grijs gemarkeerd in figuur 5A (δ 7.40 tot 7.43), wat overeenkomt met een specifieke resonantie (triplet) van PAG voor een groep van zeven dieren.

^Een H met hoge resolutie Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR spectroscopie is een niet-destructieve techniek die een snelle en reproduceerbare overnames van metabolische profielen van elke vorm van biopsie ¹⁸ mogelijk maakt. In dit protocol, gebruikten we deze krachtige techniek om een ​​hepatische metabole profiel van twee muizen te verkrijgen voor (blauw) en na (rood) kolonisatie (Figuur 6). Dit cijfer illustreert goed de informatie die kan worden afgeleid uit een MAS NMR-based metabole profiel. Tal van aminozuren als metabolieten afgeleid van energetische stofwisseling, zoals glucose, glycogeen, lactaat, triglyceriden, (D)-3-hydroxybutyraat en nicotinurate kunnen worden gevisualiseerd. Deze profielen bevatten ook informatie met betrekking tot oxidatieve stress (dat wil zeggen ascorbinezuur eencid, glutathion), nucleotide metabolisme (dat wil zeggen inosine, uridine) en methylamine metabolisme (dat wil zeggen choline, trimethylamine-N-oxide). In dit voorbeeld is het zeer duidelijk dat de kiem-vrije muis bijna geen glycogeen en een zeer lage hoeveelheden glucose en triglyceriden zo is eerder gepubliceerd ⁷ weergegeven.

Figuur 1. Overzicht van de kolonisatie protocol. Kiemvrije en conventionele dieren zijn gehuisvest in kooien zijn uitgerust met filters naast elkaar en hun nesten worden uitgewisseld om progressieve kolonisatie toestaan ​​van de conventionele darmflora (1). Gut microbiële activiteit wordt gecontroleerd met behulp van ^een H-NMR-based metabool profiel (2-3). Metabolisme in de lever wordt beoordeeld door ^een H-HR MAS NMR-based metabool profiel (4-5).

Figuur 2. Muis levenr anatomie. De lever wordt weergegeven, zoals de platte kant van het orgel kijkt uit op de tafel. Voor reproduceerbare biopten, wordt geadviseerd om altijd monsters van het centrum van de linker kwab, zoals aangegeven door de gestippelde rechthoek.

Figuur 3 1.7 mm NMR capillaire kit om te werken met microvolumes Key:.. 1: 2,5 mm NMR microbuisjes, 2: 1,7 mm NMR capillaire buis, 3: Capillaire adapter, 4: Extraction staaf.

. Figuur 4 MAS rotor apparatuur Key: 1.: MAS rotor, 2: 50 uL Teflon spacer, 3: thead pin, 4: cap, 5: cilindrische schroef, 6: schroevendraaier, 7: rotor packer, 8: dieptemeter.

Figuur 5. Evolutie van de urine tijdens de metabole profielen colonization.

1. Zoom in op de aromatische gebied van de spectra tussen 6.8-7.8 ppm, waar microbiële co-metabolieten kan worden gevisualiseerd. ¹ H-NMR-spectra werden afgeleid uit een enkel individu op dag 0 (blauw), 4 (groen), 15 (oranje) en 20 (rood) post-kolonisatie. De grijze zone komt overeen met het gebied dat werd geïntegreerd in het schema te maken in B. Key: 1-MeHistamine: 1-methylhistamine; Indoxyl-S: Indoxyl sulfaat; Zijn: Histidine, p-cresol-S: p-Kresol sulfaat; PAG : Phenylacetylglycine.
2. Gemiddelde PAG concentratie tijdens kolonisatie (n = 7). Student's t-test werd gebruikt om het verschil in concentratie PAG te vergelijken op verschillende tijdstippen: a: p <0,05 ten opzichte van dag 0, b: p <0,01 ten opzichte van dag 10.

Figuur 6. Typische 600 MHz ¹ H HR-MAS NMR-spectra van de lever biopten uit kiemvrije (blauw) en ex-kiem-vrije (red) muizen. Vet protonen zijn verantwoordelijk voor de triglyceride resonantie Key:. 3-HB: 3-hydroxybutyraat, GSH: gereduceerd glutathion, TG: Triglyceriden, TMAO: Trimethylamine-N-oxide.

Discussie

In dit protocol beschreven we een progressieve kolonisatie procedure in een open omgeving om verder te onderzoeken de impact van de darmflora op levermetabolisme beoordeeld door ^een H-HR-MAS NMR profilering van intacte biopsie. Verschillende methoden van kolonisatie zijn beschreven in de literatuur. De meest voorkomende methoden om dieren te koloniseren met een gedefinieerde microbiota zijn orale sondevoeding of verontreinigd drinkwater ^19,20. Fecale inoculatie kan ook gebruikt worden zoals hiervoo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties
2,5 mm microbuisjes	New Era	NE-H5/2.5-V-Br
1,7 mm capillair	Sigma-Aldrich	NORS175001
Capillaire adapter	New Era	NE-325-5/1.7
Extractie staaf	New Era	NE-341-5
HR-MAS rotor BL4 met 50 ui sferische Teflon spacer kit	Bruker	HZ07213
Toolkit voor 50 uL inserts	Bruker	B2950
Advance III 600MHz NMR	Bruker
1 H HR-MAS NMR solide probe	Bruker
Deuteriumoxide 99,9%	Sigma-Aldrich	530867-1L
3 - (trimethylsilyl) propionzuur zuur-d 4 (TSP)	Sigma-Aldrich	269913