$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
De eukaryote cel steunt op complexe, sterk gereguleerd en functioneel verschillende membraan gebonden compartimenten die een biochemische polariteit noodzakelijk te bewaren voor een goede cellulaire functie. Begrijpen hoe de enzymen, eiwitten, en het cytoskelet componenten besturen en onderhouden van deze biochemische scheiding is dan ook van het grootste belang. Het gebruik van fluorescent gelabeld moleculen te lokaliseren en / of verstoren subcellulaire compartimenten heeft een schat aan kennis en ons begrip van cellulaire regelgeving. Beeldvormingstechnieken zoals fluorescente confocale microscopie en maakt bepaling van de positie van een fluorescent gelabeld kleine molecule relatief eenvoudig, is echter de resolutie van zeer kleine beperkt 1.
Anderzijds heeft elektronenmicroscopie details bekend van subcellulaire morfologie bij zeer hoge resolutie, maar de statische aard is het moeilijk te meten zeer dynamische proprocessen met precisie 2,3. Dus de combinatie van lichtmicroscopie met elektronenmicroscopie van hetzelfde monster, genoemd Correlatieve licht-en elektronenmicroscopie (CLEM) 4,5, biedt de dubbele voordelen van ultrasnelle fluorescente beeldvorming met de hoge resolutie van elektronenmicroscopie 6. Deze krachtige techniek is geïmplementeerd om vele aspecten van celbiologie 5,7 bestuderen. Sinds haar oprichting heeft deze procedure vergroot ons vermogen om subcellulaire architecturen en morfologie met een hoge resolutie te onderscheiden.
Hier geven we een gestroomlijnde werkwijze voor het uitvoeren snel gevolgd door micro-injectie CLEM (Fig. 1). De microinjectie CLEM procedure kan worden gebruikt om bepaalde hoeveelheden kleine moleculen en / of eiwitten rechtstreeks in de eukaryote cel cytoplasma en onderzoeken de effecten van millimeter tot meerdere nanometer resolutie (Fig. 2). De techniek is gebaseerd op microinjectingcellen gekweekt op laser geëtst glas gerasterde dekglaasjes aan de onderkant van levende cellen gerechten en imaging zowel confocale fluorescente en elektronenmicroscopie. Lokalisatie van de cel (len) plaats wordt vergemakkelijkt door het rasterpatroon, dat gemakkelijk wordt, overgebracht samen met de cellen van belang, de EPON hars gebruikt voor immobilisatie van monsters en snijden voor elektronenmicroscopie analyse (Fig. 3). Overlay van fluorescerende en EM foto laat de gebruiker toe om de subcellulaire lokalisatie alsmede morfologische en / of ultrastructurele veranderingen geïnduceerd door de microgeïnjecteerde molecule plaats (Fig. 4). Deze techniek is ontvankelijk voor tijdstippen van ≤ 5 s tot enkele uren, afhankelijk van de aard van de microgeïnjecteerde monster.