Een Ex vivo Voorbereiding wordt beschreven voor het isoleren van de grootste gracilis spier weerstand arteriolen is voor raadpleging van zowel vasculaire reacties op vasoactieve stimuli en de beoordeling van de fundamentele structurele eigenschappen via passieve muur mechanica.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
De Ex vivo Geïsoleerd Skeletal microvaatjes Voorbereiding Voor het onderzoek van vasculaire reactiviteit
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De geïsoleerde microvaatjes voorbereiding is een ex vivo voorbereiding die het mogelijk maakt voor het onderzoek van de verschillende bijdragen van de factoren die de controle bloedvaten, en dus perfusie weerstand 1-5. Dit is een klassiek experimenteel preparaat dat, was in hoge mate, in eerste instantie beschreven door Uchida et al. 15. Enkele decennia geleden. Deze eerste beschrijving vormt de basis voor de technieken die op grote schaal werd gewijzigd en aangevuld, met name in het laboratorium van Dr Brian Duling aan de Universiteit van Virginia 6-8, en we presenteren een huidige aanpak op de volgende pagina's. Deze voorbereiding zal specifiek verwijzen naar de gracilis arteriole in een rat als het microvaatje van keuze, maar de basis bereiding gemakkelijk kan worden toegepast op schepen geïsoleerd van bijna elk ander weefsel of orgaan bij verschillende diersoorten 9-13. Mechanische (dat wil zeggen, dimensionaal) veranderingen in de geïsoleerde micro-vaatjes kan gemakkelijk worden geëvalueerdin antwoord op een breed scala van fysiologische (bijvoorbeeld hypoxie, intravasculaire druk of afschuiving) of farmacologische problemen en kan inzicht in mechanische elementen die geïntegreerd reacties in een intacte, maar ex vivo, weefsel. De betekenis van deze methode is dat het mogelijk maakt gemakkelijke manipulatie van de invloeden van de geïntegreerde regulering van diameter microvaatje, en daarbij tevens de controle van vele van de bijdragen van andere bronnen, zoals intravasculaire druk (myogene) autonome innervatie hemodynamische ( bijvoorbeeld, shear stress), endotheel afhankelijke of onafhankelijke stimuli, hormonale en parenchymale invloeden, om een deel van de lijst te verstrekken. Onder geschikte proefomstandigheden en met geschikte doelen kan dit als een voordeel ten opzichte in vivo of in situ weefsel / orgaan preparaten, die niet gemakkelijk mogelijk om de eenvoudige besturing van bredere systemische variabelen.
Het major beperking van dit preparaat in hoofdzaak het gevolg van de sterke. Per definitie is het gedrag van deze schepen wordt bestudeerd onder omstandigheden waar veel van de meest belangrijke mate bijdragen aan de regulering van vasculaire weerstand hebben afgeschaft, ook neurale, humorale, metabole, enz. Als zodanig wordt de onderzoeker gewaarschuwd om over-te voorkomen de interpretatie en de extrapolatie van de gegevens die worden verzameld gebruik te maken van deze voorbereiding. Het andere belangrijke punt van zorg met betrekking tot deze voorbereiding is dat het kan heel gemakkelijk om cellulaire componenten zoals de endotheliale bekleding of de vasculaire gladde spieren beschadigen, kunnen dergelijke die variabele bron van fouten worden ingevoerd. Het wordt ten zeerste aanbevolen dat de individuele onderzoeker juiste metingen om de kwaliteit van de voorbereiding te garanderen gebruiken, zowel bij de start van het experiment en periodiek in de loop van een protocol.
Protocol
1. Voorafgaand aan de Experiment
- Voorafgaand aan het experiment dag worden capillaire glazen buisjes van geschikte afmetingen van het station in getrokken micropipetten (een horizontale of verticale puller worden gebruikt). De tip diameter kan gemakkelijk worden aangepast afhankelijk van het schip wordt geïsoleerd, hoewel we over het algemeen een diameter gebruiken tussen 50-150 urn. Deze worden vervolgens gebogen om de configuratie van het microvaatje station volgende verwarming op een butaanvlamproef. Micropipet tips zijn fysiek gebroken om de geschatte diameter (met fijne tang) voor het microvaatje in kwestie en kunnen geslepen of gepolijst om de juiste....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De gepresenteerde protocol beschrijft de isolatie, de verwijdering en dubbele cannulatie van een skeletspier microvaatje, hoewel dit algemene techniek gemakkelijk kan worden toegepast op de meeste weefsels. Voor de huidige manuscript, is de term "arteriole" is gebruikt door de auteurs op een weerstand schip variërend van 70 tot 120 micrometer in diameter onder rust actief toon, die ook een belangrijke bijdrage aan de regulering van perfusie weerstand tegen een orgaan of te beschrijven weefsel.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association (EIA 0740129N) en NIH T32 HL90610.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagentia en apparatuur | Vennootschap | Opmerkingen / Catalogus # | |
| Schip Kamer | Gewoonte | Dave Eick (MCW) | |
| Verwarmde circulerende water bad | PolyScience en Haake | Haake DC 10 | |
| Pipetten | Frederick Haer & Co | Capillaire buis 2,0 mm OD x 1,0 mm ID (27-33-1) | |
| Pressure Monitor | Wereld Precision Instruments | ||
| Watermantel Reservoir | Gewoonte | ||
| Externe lichtbron | Wereld Precision Instruments | Novaflex | |
| Pipet Puller | Microdata Instrumenten | PMP102 micropipet Puller | |
| Volledige voltooiingling van chirurgische instrumenten | Fine Science Tools | Dumont | |
| Ultra Fine tang | Fine Science Tools | Inox # 5 | |
| Silk hechtdraad | Ethilon | # 10-0 of 9-0 | |
| Stereo Microscoop | Olympus | Olympus SZ-11 | |
| Analoge video Schuifmaten | Boeckeler | Via Controller (Via-100) | |
| Hoge resolutie analoge camera | Panasonic | GP-MF 602 | |
| Zuurstoftank | Regionaal | 21% rest stikstof en 5% CO2 rest stikstof | |
| Buis | Tygon | ||
| Laat de pomp | Cole Parmer Instrument Co | ||
| Gewijzigd Rat PSS | Zie recept | ||
| Relaxant PSS van Breemen's | Zie recept |
Tabel 1. Een lijst van de belangrijkste componenten van geïsoleerde microvaatjes station setup gepresenteerd in de figuren.
| Gewijzigd Rat PSS Recept | Om twee liter PSS te maken | 20X Salt Stock (2L) | 20X buffervoorraad (2L) |
|---|---|---|---|
| NaCl | 278,0 g | ||
| KCl | 14,0 g | ||
| MgSÜ4-7H 2 O | 11,5 g | ||
| CaCl2-H 2 O | 9,4 g | ||
| NaHCÛ3 | 80,8 g | ||
| EDTA | 0,4 g | ||
| NaH 2 PO 4 | 0,28 g | ||
| Glucose | 1,98 g | ||
| 20x Zout Stock | 100 ml | ||
| 20x buffervoorraad | 100 ml | ||
| Gedestilleerd water | 1800 ml |
Tabel 2. Recept voor standaard fysiologische zoutoplossing (PSS) van de geïsoleerde microvaatje protocollen.
Reacties op Recept: Maak 2 L van Salt Stock en 2 L van de buffervoorraad. Deze ceen koelkast worden bewaard als deze niet wordt gebruikt, maar schud ze goed en vaak voor de voorbereiding van PSS. De extra bestanddelen worden toegevoegd bij de bereiding van definitieve PSS.
| Relaxant PSS van Breemen's | Om 2 liter PSS te maken | 20X Salt Stock (1L) | 20X buffervoorraad (1L) |
|---|---|---|---|
| NaCl | 107,4 g | ||
| KCl | 7,0 g | ||
| MgSÜ4-7H 2 O | 5,76 g | ||
| MgCl2-6H 2 O | 81,32 g | ||
| NaHCÛ3 | 40,4 g | ||
| EDTEen | 0,2 g | ||
| EGTA | 15,22 | ||
| NaH 2 PO 4 | 0,28 g | ||
| Glucose | 1,98 g | ||
| 20x Zout Stock | 100 ml | ||
| 20x buffervoorraad | 100 ml | ||
| Gedestilleerd water | 1800 ml |
Tabel 3. Recept voor relaxerend fysiologisch zout Van Breemen De oplossing van (PSS) gebruikt in de geïsoleerde microvaatje protocollen, onder de voorwaarden van nul actieve toon.
Reacties op Recept: Maak 1 L van Salt voorraad Eennd 1 L van de buffervoorraad. Deze kunnen in de koelkast wanneer deze niet wordt gebruikt, maar schud ze goed en vaak voor de voorbereiding van PSS. De extra bestanddelen worden toegevoegd bij de bereiding van definitieve relaxerende PSS.
Referenties
- Goodwill, A. G., Frisbee, S. J., Stapleton, P. A., James, M. E., Frisbee, J. C. Impact of Chronic Anticholesterol Therapy on Development of Microvascular Rarefaction in the Metabolic Syndrome. Microcirculation. , 1-18 (2009).
- Goodwill, A. G., James, M. E., Frisbee, J. C.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Tags
Isolatie van microvatenex vivo vasculaire reactiviteitcanulatietechniek voor microvatenmeting van vaatdiameterfysiologische zoutoplossingchirurgische isolatie van microvatenintravasculaire drukbelastingbeoordeling van de endotheelfunctietonus van het vasculaire gladde spierweefselmicrovasculaire perfusieweerstand
