Het creëren van voorbijgaande celmembraan poriën met een standaard inkjetprinter

Samenvatting

Een beschrijving van de methoden die worden gebruikt om een ​​HP DeskJet 500-printer te zetten in een bioprinter. De printer kan verwerken levende cellen die transient poriën veroorzaakt in het membraan. Deze poriën kan worden gebruikt om kleine moleculen zoals fluorescerende G-actine nemen in de gedrukte cellen.

Samenvatting

Bioprinting heeft een breed scala van toepassingen en het belang, met inbegrip van tissue engineering, directe cel applicatie therapieën, en biosensor microfabricage. ^1-10 Onlangs heeft thermische inkjettechnologie ook gebruikt voor gen transfectie. ^8,9 De thermische inkjet printing proces werd aangetoond dat tijdelijk verstoren de celmembranen zonder dat dit invloed levensvatbaarheid van de cellen. De tijdelijke poriën in het membraan kunnen worden gebruikt om moleculen die anders te groot zijn om door het membraan in de cytoplasma. ^8,9,11 voeren

De toepassing wordt hier gedemonstreerd is het gebruik van thermische inkjettechnologie voor de integratie van fluorescent gelabelde g-actine-monomeren in de cellen. Het voordeel van thermische inktstraaldrukkers om moleculen injecteren in cellen is dat de techniek relatief goedaardige aan cellen. ^{8, 12} levensvatbaarheid van de cellen na afdruk is gebleken dat vergelijkbaar met standaard cel plaTing methoden ^1,8. Daarnaast kunnen inkjet printen verwerken duizenden cellen in een paar minuten, dat is veel sneller dan handmatige micro-injectie. De poriën die door drukken is gebleken sluiten binnen ongeveer twee uur. Er is echter een grens aan de grootte van de poriën gemaakt (~ 10 nm) met deze druktechniek, waarbij de techniek beperkt tot injecteren cellen met kleine proteïnen en / of deeltjes. ^8,9,11

Een standaard HP DeskJet 500-printer is gewijzigd, zodat voor cel af te drukken. ^{3, 5, 8} De deksel van de printer werd verwijderd en het papierinvoermechanisme was gepasseerd behulp van een mechanische hefboom. Een podium is gemaakt om voor de plaatsing van objectglaasjes en dekglaasjes kan direct onder de printkop. Inktpatronen werden geopend, de inkt werd verwijderd en ze werden gereinigd voor gebruik met cellen. De drukkerij patroon is gemaakt met behulp van standaard tekensoftware, die vervolgens de printer gecontroleerd door middel van een eenvoudige printopdracht. 3T3 fibroontploffing werden gekweekt tot confluentie, getrypsiniseerd, en vervolgens opnieuw gesuspendeerd in fosfaat gebufferde zoutoplossing met oplosbare fluorescent gelabelde g-actine-monomeren. De celsuspensie werd gepipetteerd in de inktpatroon en lijnen cellen werden gedrukt op microscoopglasplaatjes dekglaasjes. De levende cellen werden afgebeeld met behulp van fluorescentie microscopie en actine werd gevonden in het cytoplasma. Integratie van TL-actine in de cel zorgt voor beeldvorming van de korte tijd cytoskelet dynamiek en is nuttig voor een breed scala aan toepassingen. ^13-15

Protocol

1. Het omzetten van de HP DeskJet 500

Er zij opgemerkt dat deze techniek moeten werken met veel commercieel inkjetprinters. Echter, ouderen printers neiging om te werken beter als ze inkt met grotere diameter sproeiers, die niet verstoppen zo gemakkelijk te gebruiken. Daarnaast oudere printers hebben de neiging om mechanische papierinvoer sensoren die zijn makkelijker te omzeilen gebruiken. Printers met optische sensoren kunnen worden bedrogen, maar met behulp van een kleine strook papier aan de andere kant van de printer tijdens elke cyclus, maar is een beetje moeilijker dan het mechanische systeem op "truc". De momenteel in de handel verkrijgbare printers die het beste werken hebben een lage resolutie (DPI).

Hogere resolutie printers de neiging om meer gemakkelijk verstopt raken. De resolutie van de HP Deskjet 500 is 300 DPI. Er zijn vele in de handel verkrijgbare printers (HP Deskjet serie en anderen), dat een resolutie van 600 DPI te hebben. Dit type printer kan worden gebruikt met slechts een kleine verhoging in het mondstukverstopping problemen die kunnen worden verlicht met behulp van zorgvuldige reiniging (deel 3).

1. Verwijder de bovenste plastic behuizing van de printer door het ontsluiten diverse kunststof clips van de onderkant voet van de printer en langzaam het opheffen van de top uit.
2. Draai de knop / display licht paneel van de bovenkant van de printer, waarbij het is aangesloten op het moederbord van de printer.
3. Reinig de binnenkant van de printer, in het bijzonder de gebieden waar de cartridge rust en waar drukwerk optreedt.
4. Zoek de kabels stroom aan de papierinvoer mechanismen en haal ze van het moederbord.
   1. In de HP DeskJet 500, die net onder de lade naar links van de voorzijde.
5. Zoek papier detectie mechanisme. Bypass het mechanisme door het aanbrengen van een koord of draad lus om te dienen als een handleiding pull handvat.
   1. In de HP DeskJet 500, het papier detectie mechanisme is een grijze plastic hendel gevonden boven en achter de drukkerij / papierinvoermechanisme.
6. Een fase voor het papierinvoermechanisme (waarbij de papier wordt toegevoerd uit en gedeponeerd) om de gewenste druk dia brengen tot een niveau vlak onder de printkop patroon.
   1. Voor onze experimenten werd het schuim verzending houder 15 ml centrifugebuizen gebruikt met verschillende microscoopglaasjes tape in plaats van de druk regio het eindniveau van de dia op het gewenste hoogte.
7. Om aseptische techniek te behouden, kan de printer worden geplaatst in een standaard biohazard kast of tafel laminaire stroming kap.
8. Het is belangrijk op te merken dat het wijzigen van een in de handel verkrijgbare inkt-jet printer meestal van de printer fabrikant garantie.

2. Het omzetten van Stock HP inktcartridges (HP 26 zwarte inktcartridge)

1. Verwijder de cartridge uit de verpakking, waardoor de beschermende tape op de printer contacten en printkop voor het moment.
2. Stabiliseren van het lichaamvan de cartridge (zwart gedeelte) ofwel met een klem of bankschroef (gewoon stevig vastgrijpen van de cartridge met de hand gewoonlijk werkt ook), waardoor de groene top uit de buurt van een obstakel.
3. Met behulp van een tang of een verstelbare sleutel, pak de groene bovenkant van de cartridge en draai heen en weer een paar keer tot het breekt vrij.
   1. Dit niet veel kracht, maar de bovenste niet meer nodig, zodat het goed als breekt wanneer verwijderen.
4. Met behulp van schroevendraaiers, wrikken uit de doorzichtige plastic stuk nu bloot.
   1. Ook zou dit niet veel kracht, maar niet nodig, zodat het goed als breekt tijdens het verwijderen.
5. Giet het resterende uit het reservoir.
6. Verwijder de plastic beschermkap tape op de printer contacten en printkop.
7. Spoel de reservoirs met water.
   1. Gebruik een pipet of spuit het water te duwen door de kanalen.
   2. Water zal waarschijnlijk lekken uit de printkop tijdensDit proces, dat aanvaardbaar is en geen schade toebrengen aan de functionaliteit van de cassette.
8. Als het water helder blijft, laat de cartridge om te drogen.

3. Reiniging inktcartridge

1. Om een ​​schoon printomgeving houden, moet de cartridge worden gereinigd en na gebruik.
   1. Dit helpt ook met het vermijden van kristallisatie van zouten en andere biologisch materiaal in de cartridge die kunnen verstoppingen veroorzaken.
2. Volledig onderdompelen de cartridge in een bekerglas vol met gedeïoniseerd water en ultrasone trillingen gedurende 15 minuten voor en na het afdrukken.
3. Na sonicatie, verwijdert u de cartridge uit het water, en schud het overtollige water.
4. Spray 70% ethanol in de cartridge om een ​​aseptische omgeving te creëren.
   1. Zorg ervoor dat de ethanol is opgedroogd voordat u de bioink printoplossing.

4. Het maken van celsuspensie - "Bioinkt "

1. Cultuur-cellen tot het moment van passage.
   1. Voor 3T3 fibroblasten: Seed cellen T-75 kolven ongeveer 1.3x10 ⁴ cellen / cm ² Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS). Kweekcellen twee dagen in een incubator bij 37 ° C en _5% CO2.
2. Merk fluorescerende g-actine stockoplossing een concentratie 50 pg / ml in fosfaatbufferoplossing (PBS).
3. Passage cellen.
   1. Voor 3T3 fibroblasten: Verwijder het afdrukmateriaal uit kolf en tweemaal met PBS te spoelen. Bedek cellen met 5 ml 0,25% trypsine + EDTA en incubeer gedurende 5 minuten.
   2. Voeg 5 ml vers medium en pipetteren de celsuspensie in een 15 ml centrifugebuis conische centrifuge bij 1000 rpm gedurende 5 minuten. Zuig besteed medium.
4. Resuspenderen de cellen in PBS met fluorescerende g-actine stockoplossing bioink maken.
   1. Bioink moet een eindconcentratie van g-actine van 10 ug / ml en een cel concentration van 1x10 ⁵ cellen / ml. Deze concentratie is geoptimaliseerd voor het bedrag beperken cellen per drop en verstopping van de printkop. ⁸
   2. Merk op dat 250 ul van bioink drie dekglaasjes met het patroon in figuur 2 drukt.

5. Bioprinting

1. Voeding aan en laat de printer op te warmen.
2. Place gewenste drukoppervlak (hier we 22 mm x 22 mm dekglaasjes) in het midden van de fase bereid in stap 1.6.
3. Maak een drukkerij patroon bestand.
   1. Open Microsoft Word (of een andere tekening software), en teken het gewenste patroon.
   2. Kies een gewenste afdrukinstellingen patroon voor cel afdrukken in de premade bestand.
4. Plaats de voorbereide cartridge met de gewenste celsuspensie.
   1. Pipetteer suspensie in de kleine cirkelvormige en op de bodem van cartridgevak. Gebruik circa 100-120 ul oplossing. De gedrukte druppelgrootte is ongeveer 130picoliter ^8.
5. Print het bestand met de HP Deskjet 500 printer.
   1. Voor de beste resultaten af ​​te drukken kleinere patronen meerdere keren (5), door het veranderen van het aantal kopieën gewenst in het tekstverwerkingsprogramma.
6. Printer weer op te warmen, dan cartridge gaat naar de "klaar positie".
7. Bij het patroon beweegt in de gereed positie (iets naar links van de inkt infuus ver onder en blijft daar), trekt u het papierinvoermechanisme draad, en het afdrukken te beginnen.
   1. Voor meerdere exemplaren van het drukken, zal het papierinvoermechanisme moeten worden vrijgegeven na elke cyclus of pagina afgedrukt. De cartridge zal dan terug naar de "klaar" te zetten, en het papierinvoermechanisme draad moet weer worden verhoogd.
8. De printer drukt op het dekglaasje geplaatst op het midden van de drukkerij stap in stap 5.2 (zie figuur 2).

6. Representatieve resultaten

De representatieve resultaten van het hele conversieproces van een standaard, off-the-shelf HP Deskjet 500, zal standaard HP 26-serie cartridges zorgen voor een printer met de mogelijkheid van het afdrukken van mobiele oplossingen voor veel soorten analyses zoals eerder vermeld. De voltooide printer na omzetting wordt getoond in Figuur 3 met een drukfase de microscoop dekglas plaatsen op. De printer kan nuttig zijn in de analyse op vele gebieden, met inbegrip van maar niet beperkt tot: enkele cel mechanica, weefsel-, gen transfectie, biosensor micropatterning, en directe celtherapie ^{1-10, 16-22.}

In dit voorbeeld werden een HP Deskjet 500 printer en HP 26-serie inktpatronen aangepast voor bioprinting. Met deze opstelling met een printer bioink bestaande uit een fibroblast celsuspensie in een g-actine monomeeroplossing werden cellen gedrukt op microscoopglasplaatjes dekglaasjes. Figuur 1 illustreert representatieve res ULT's van gedrukte fibroblast cellen, die opgenomen tl-actine monomeren te laten zien. De resultaten werden verkregen in een gecontroleerde aseptische omgeving waarin de cellen werden gedrukt in aanpasbare patronen.

Het patroon wordt gebruikt in dit voorbeeld is gemaakt in Microsoft Word (figuur 2). Dit patroon heeft een ononderbroken lijn van de gedrukte oplossing in de meeste microscoopglaasje. Figuur 4 toont de rechte lijn in de bioink en cellen elkaar afgezet. Opgemerkt dat direct na het printen, is er een toename van achtergrond fluorescentie omdat bioink oplossing waarin de cellen gesuspendeerd bevat vrije overmaat fluorescerende actine monomeren. Deze achtergrond fluorescentie vermindert aanzienlijk na de toevoeging van groeimedia de cellen (Figuur 1), waarbij een overmaat monomeer wast van het substraat.

ad/3681/3681fig1.jpg "/>
Figuur 1. Afbeeldingen slechts ter illustratie van de 3T3 fibroblasten 3 uur na het afdrukken met behulp van de gemodificeerde inkjet printer. Het interieur van de cellen geven opgenomen fluorescent gelabeld actine monomeren. Schaal balken geven 50 um.

Figuur 2. Dat werd gebruikt ter bioink af te drukken.

Figuur 3. Printer na conversie met piepschuim podium. De oranje draad in het midden omzeilt de papierinvoer hendel sensor.

Figuur 4. Representatief beeld van 3T3 fibroblasten gedrukt in een plaatselijke drukkerij zone. Microscopie beeld dat vijf minuten na het afdrukken bij 20x vergroting.

/ Files/ftp_upload/3681/3681fig5.jpg "/>
Figuur 5. Fluorescence beeld (40x vergroting) genomen 3 uur na het drukken met een fibroblast met geïnternaliseerde fluorescerende actine monomeren. Schaal balk vertegenwoordigt 50 um.

Figuur 6. Fluorescentie microscopie (20x vergroting) van een cel die 15 minuten na het afdrukken. Het beeld toont zowel g-actine (groen) en de kern (blauw). Van links naar rechts: G-actine met Alexa Fluor 488, kern met DAPI, en een overlay van beide.

Figuur 7. Fluorescentie microscopie die twee fibroblasten in een lijn patroon 3 uur na het afdrukken. Afbeelding links toont fluorescent gelabelde actine-monomeren in de cellen. Afbeelding rechts is een overlay van de tl-kanaal met de achtergrond afbeelding om te laten zien dat, hoewelkan er wat vuil op de foto (linksonder) te zijn, is het niet fluoresceren. Schaal balken geven 50 pm Als grootte niet aangegeven extreem-rechts is een controlegroep van niet-gedrukte cellen geïncubeerd gedurende 3 uur met fluorescent gelabeld monomeren. Deze controle is aan te tonen dat monomeren niet de celmembraan dringen zonder membraan permeabilisatie door cel afdrukken.

Discussie

Het proces om een ​​standaard inkjet desktop printer voor bioprinting is niet bijzonder moeilijk. De meest uitdagende stap is het bepalen van hoe het papierinvoermechanisme, die afhankelijk is van het merk en model van de printer gebruikt te omzeilen. Dit is echter relatief eenvoudig de papierinvoer sensor mechanische zoals hier beschreven. Voor modellen met optische-feed sensoren, kunnen andere technieken moeten worden ingezet om de printer te laten denken is het papier met behulp van, bijvoorbeeld, kan men een klein stukje papier door de printer tijdens het afdrukken op de microscoop dia. Het omzeilen van de papierinvoermechanisme is waarschijnlijk de moeilijkste stap in de toepassing van deze procedures om andere printer modellen.

Bij de bouw van een fase van de dekglaasjes vasthouden voor het drukken is het belangrijk om een ​​goede uitlijning en hoogte. Het podium moet het mogelijk maken voor het dekglaasje te worden geplaatst in het midden van het afdrukgebied. Bovendien, het zou moeten place het dekglaasje op een voldoende hoogte om goedkeuring voor de inktpatroon door te geven over de dia zonder verstoring van het. De exacte hoogte van de fase zal afhangen van de printer model.

Om ervoor te zorgen dat de afgedrukte cellen niet weg te krijgen gewassen, werden de dia's in een incubator geplaatst direct na het afdrukken van ongeveer 30 minuten om voor celhechting voordat aanvullende celgroei media werd toegevoegd. Omdat de cellen werden gedrukt in een oplossing die veel PBS de cellen niet uitdroogt en bleef levensvatbare omvat. Cellen werden belicht met fluorescentiemicroscopie de verdeling van het gelabelde g-actine monomeren in de cel (figuren 1, 5-7) visualiseren. Bij het ​​afdrukken van 3T3 fibroblasten, Figuur 5 toont een representatief resultaat met actine waardoor veel van de cel te fluoresceren maar presentatie lijnen van verhoogde helderheid. De integratie van fluorescent gelabeld g-actine in het cytoskelet isnuttig voor de studie van cytoskelet dynamiek en cellulaire mechanica. ^12-15 Een beperking van deze techniek is dat alleen voor moleculen en eiwitten die diameters kleiner dan ongeveer 10 nm.

Om cellen daadwerkelijk worden verwerkt door de printer omgezet, werd DAPI (1:5000 in PBS) aan het bioink in plaats van de helft van het volume zuivere PBS. De fluorescerende vlek DAPI bindt aminozuur rijke porties DNA in de kern. Daarom DAPI is nuttig vlek in fluorescent beeldvorming kernen van de gedrukte cellen. Figuur 6 toont een representatief beeld van een cel getoond zowel Alexa Fluor 488 (actine) en DAPI (kern) fluorescentie met een overlaybeeld van beide. Figuur 7 illustreert hoe de cellen eenmaal lichten de g-actine monomeren zijn opgenomen, terwijl niet-biologisch materiaal dat is afgezet in het monster niet fluoresceren door de absence van g-actine monomeren.

Een belangrijke overweging voor bioprinting is de waterige media wordt gebruikt voor de bioink. Het bleek dat met behulp van standaard celgroei media met serum inconsistente resultaten opgeleverd. Dit is waarschijnlijk te wijten aan verstopping van de print-spuitkanaaltjes door serum eiwitten. Het gebruik van PBS om de consistentie van gedrukte patronen en het aantal cellen, werd gedeponeerd. Een nadeel van PBS dat cellen niet worden gelaten in de suspensie gedurende langere tijd. Echter, fibroblasten in deze voorbeelden waren in staat om de bioink voorwaarden voor minstens een uur tolereren, zonder verandering in de levensvatbaarheid van de cellen. Dit is consistent met diverse eerdere bevindingen, die melden dat cellen afgedrukt via thermische inkjet mechanismen is aangetoond dat een hoge levensvatbaarheid tarieven. ^2-8

Deze aangepaste installatie van de printer kan worden gebruikt voor andere toepassingen dan de cel af te drukken. ^16-22 Matrix eiwitten, zoals collageen of fibronectin, gemakkelijk kunnen worden afgedrukt op substraten met deze techniek, die nuttig zijn voor cellen patronen. Bijvoorbeeld collageen type I gedrukt in lijn zal resulteren in lijn collageen substraten die kunnen worden gebruikt voor in vitro celkweek studies. ¹⁷ Naast matrixeiwitten andere moleculen, zoals groeifactoren, betrouwbaar kan worden gelokaliseerd op substraten voor celstudies en potentiële therapeutische toepassingen. ¹⁸

Een belangrijke beperking van het ontwerp zoals hierboven beschreven stappen is dat deze printer niet kan afdrukken in meer dan een dimensie. Dit beperkt de mogelijkheden voor gebruik in patroon toepassingen zoals steiger afdrukken. Om voor 3D-printing, een gespecialiseerde stadium moet worden gebruikt. Het podium dient te beschikken over incrementele hoogte verstelbaar voor laag-voor-laag afzetting van bioink.

Bioprinting heeft aangetoond belofte als een efficiënte en kosten-effectieve methode voor tissue engineering, Gen transfectie micropatterning en microarray fabricage ^{1-12, 16-22} De toekomstige toepassingen van dergelijke inrichting zijn vele, waaronder:. Creëren van gecontroleerd en patronen cellulaire micromilieus, opname van macromoleculen in cytoplasma en afzetting van cellen op steigers en structuren die niet de natuur voorkomen of efficiënt.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
HP DeskJet 500	Hewlett-Packard	C2106A	Beëindigde van de fabrikant. Gekocht gerenoveerde december Trader.
HP 26 zwarte inktcartridge	Hewlett-Packard	51626A
Actin van konijn spieren, Alexa Fluor 488 conjugaat, 200 pg	Invitrogen	A12373
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)	MP Biomedicals	ICN1860454
Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM)	Thermo Scientific	SH3002201
Foetaal runderserum	Sigma-Aldrich	F4135
Amfotericine B	Sigma-Aldrich	A2942	Gebruikt op 0,5% in de media voor celkweek
Penicilline-streptomycine	Sigma-Aldrich	P4333	Gebruikt op 0,5% in de media voor celkweek
Unidirectionele Flow Clean Bench	Envirco	VLF 797	Optionele behuizing voor het houden van printer aseptische