De Neuroblast test: een test voor de generatie en de verrijking van Neuronale stamcellen uit Onderscheidende factor voor neurale stamcellen Nakomelingen met behulp van flowcytometrie

Samenvatting

Deze video protocol geeft blijk van een nieuwe methode voor het genereren en daaropvolgende zuivering van neuronale stamcellen uit een hernieuwbare bron van neurale stamcellen (NSC) op basis van hun fysieke (grootte en interne granulariteit) en fluorescerende eigenschappen met behulp van flowcytometrie-technologie.

Samenvatting

Neurale stamcellen (NSC), kunnen worden geïsoleerd en uitgebreid in op grote schaal, met behulp van de neurosphere test en gedifferentieerd in de drie belangrijkste celtypes van het centrale zenuwstelsel (CZS), namelijk, astrocyten, oligodendrocyten en neuronen. Deze eigenschappen maken neurale stamcellen en stamcellen een waardevolle hernieuwbare bron van cellen voor in vitro studies zoals drug discovery, neurotoxicology en electrofysiologie en ook voor celvervangingstherapie in veel neurologische aandoeningen. In de praktijk echter, heterogeniteit van NSC nakomelingen, lage productie van neuronen en oligodendrocyten, en overheersing van astrocyten na differentiatie beperken hun klinische toepassingen. Hier wordt beschreven een nieuwe methode voor de productie en daaropvolgende zuivering van onvolwassen neuronen van knaagdier NSC nakomelingen met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) technologie. Met behulp van deze methode kan een zeer verrijkt neuronale voorlopercellen celpopulatie worden bereikt witHout merkbare astrocyten en bonafide NSC besmetting. De procedure omvat differentiatie van NSC nakomelingen geïsoleerd en uitgebreid van E14 muis ganglion grootheden met behulp van de neurosphere test, gevolgd door isolatie en verrijking van onrijpe neuronale cellen op basis van hun fysieke (grootte en interne complexiteit) en fluorescerende eigenschappen met behulp van flowcytometrie-technologie. Over het algemeen duurt het 5-7 dagen tot neurospheres en 6-8 dagen genereren om NSC nakomelingen differentiëren en te isoleren in hoge mate gezuiverd onvolwassen neuronale cellen.

Protocol

1. Basic Set Up voor u verder gaat to Cell Cultuur

1. NeuroCult NSC basismedium en NeuroCult NSC proliferatie Supplementen worden gemengd in een verhouding van 9:1, respectievelijk volledige NSC medium te maken.
2. Een 37 ° C waterbad gebruikt wordt om op te warmen het medium.
3. Geschikte warmte geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FCS) ontdooid.
4. Passende hoeveelheid voorraad groeifactor oplossingen met epidermale groeifactor (EGF bij 10 ug / ml), basic fibroblastische groeifactor (b-FGF bij 10 ug / ml) en 0,2% heparine-oplossing in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) worden ontdooid.
5. Weefselkweekflessen (T25, T75 of & T175) zijn nodig voor NSC uitbreiding en differentiatie.
6. Weefselkweek behandeld 96 en 24 well platen en glas dekglaasjes nodig zijn voor plating gesorteerde cellen.

2. Isolatie, en uitbreiding (passage) van NSCs

1. Neurale stamcellen en voorlopercellen zijn geïsoleerd en uitgebreid van de muis bregenen, zoals beschreven in afzonderlijke protocollen ^{1, 2 3.}
2. Wanneer de neurospheres (primaire of door passage neurospheres) gereed voor subcultuur (150-200 micrometer in diameter) is de informatiedrager bollen naar geschikte grootte steriele cultuur buis en gecentrifugeerd bij 800 rpm (110 g) gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
3. De supernatant medium wordt verwijderd en de bollen opnieuw gesuspendeerd in 1 ml voorverwarmde 0,05% trypsine-EDTA.
4. Na incubatie in een 37 ° C waterbad gedurende 2-3 minuten wordt een gelijk volume soja trypsine inhibitor toegevoegd aan de celsuspensie de trypsine te beëindigen.
5. Om de trypsine volledig geïnactiveerd wordt de celsuspensie zacht gepipetteerd en neer 3-5 keer.
6. Na centrifugatie bij 800 rpm (110 g) gedurende 5 minuten, wordt de supernatant verwijderd en de cellen opnieuw gesuspendeerd in 1 ml volledig NSC medium.
7. 10μl van de celsuspensie wordt gemengd met 90 pi trypan blauw om een ​​aantal cellen uit te voeren.
   Opmerking: Andere geschikte verdunningen cel kan worden gebruikt.
   
8. De cellen worden vervolgens gebruikt voor subcultuur ^{1, 2} of differentiatie zoals hieronder beschreven.

3. Differentiatie van neurale stamcellen en progenitorcellen, The Neuroblast Assay (NBA)

1. Cellen die het resultaat van gedissocieerd neurospheres worden geplaat bij een concentratie van 2-3 x 10 ⁵ cellen / ml in hele NSC medium aangevuld met 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml bFGF, 1 ul / ml 0,2% en 5% heparine warmte geïnactiveerd FCS in een passende omvang weefselkweek kolf. 5 ml medium wordt gebruikt voor T25, 20 ml van T75 en 40 ml T175 flessen.
   Opmerking: FCS zal de cellen stevig aan het substraat en behoeft voor het bekleden van de kolven gedurende NBA cultuur.
   
2. Cultusure flessen worden vervolgens geïncubeerd in een 37 ° C bevochtigde incubator met _5% CO2 gedurende 3-4 dagen. Deze periode wordt proliferatie fase, waarin NSC nakomelingen hechten aan het substraat en vermenigvuldigen als een monolaag van cellen.
3. Wanneer de cultuur wordt 90-95% samenvloeiing, het medium van elke kolf wordt ingeschakeld om de volledige NSC medium aangevuld met 5% FCS zonder groeifactoren.
4. Kweekflessen weer geïncubeerd in een 37 ° C bevochtigde incubator met _5% CO2 gedurende nog 3-4 dagen. Deze periode noemt men differentiatie fase, waarin de neuronale voorlopercellen op de top van een astrocytaire monolaag en zich vermenigvuldigen om kolonies van onvolgroeide neuronale cellen te maken. Op dag 4-5 differentiatiestadium de cultuur klaar voor het isoleren van de cellen met behulp neuroblast flowcytometrie technologie.

4. Cell Voorbereiding voor flowcytometrie

Trypsinisatie

1. De cultuur van differentiatie NSC nakomelingen op dag 4-5 differentiatiestadium eenmaal gewassen met een geschikte hoeveelheid PBS (2 ml van T25, 4 ml van T75 en 8 ml van T175 kolf) te FCS uit de cultuur.
   Let op: FCS blokken trypsine-EDTA activiteit.
   
2. Vervolgens wordt een voldoende hoeveelheid voorverwarmde 0,05% trypsine-EDTA (2 ml van T25, 4 ml van T75 en 8 ml van T175 kolf) toegevoegd aan elke kolf de celmonolaag bedekken en geïncubeerd voor 1-2 minuten in een 37 ° C bevochtigde incubator.
3. De kolf wordt gecontroleerd onder de microscoop om het effect van trypsine-EDTA op de cultuur te evalueren. De kolf wordt vervolgens met een hand en sloeg stevig met de andere hand de cellen uit de bodem van de kolf te verwijderen.
4. Gelijke hoeveelheden van soja trypsine remmer wordt toegevoegd aan de kolf trypsine activiteit doven. De celsuspensie wordt voorzichtig gepipetteerd op en neer om trypsine inactivatie te waarborgen en een homogene enkele cel te bereikenopschorting.
   Opmerking: Als alternatief medium aangevuld met 5% FCS kunnen worden gebruikt om trypsine activiteit doven.
   
5. Om niet-gesplitste klonten te verwijderen wordt de celsuspensie geleid door een 40 pm grootte zeef.
6. De celsuspensie wordt vervolgens gecentrifugeerd bij 800 rpm (110g) gedurende 5 minuten, wordt de supernatant verwijderd en de cellen worden geresuspendeerd in een zodanige hoeveelheid van volledige NSC medium.
7. Het uiteindelijke volume van de celsuspensie wordt aangepast, zodat de cel dichtheid geen 2-3x10 ⁶ -cells/ml overschrijden. Hoge celdichtheid kunnen veroorzaken stroom blokkade in de flowcytometrie machine.
8. Als u wilt neuronale cellen alleen op basis van hun fysische eigenschappen te isoleren, nu kun je overgaan tot FACS sorteren zoals beschreven in deel 4.
9. Voor sorteren wordt propidiumjodide (PI, Sigma, 500 ug / ml in PBS) toegevoegd in een concentratie van 1 pl / ml celsuspensie dode cellen sluiten.

Leef cell immunokleuring

Om een ​​hogere zuiverheid van neuronale cellen, geoogst enkele cel uit de NBA cultuur kan worden gekleurd om de PSA-NCAM (een marker van de vroege onvolwassen neuronale voorlopercellen) en dan de positieve cellen van de neuronale populatie te bereiken kunnen worden geïsoleerd met behulp van de FACS apparaat.

1. Na het uitvoeren van een aantal cellen, is de enkele celsuspensie uit de NBA cultuur verdeeld in vier groepen:
   • Cellen groep die uitsluitend dient als een controle om de parameters en poorten (0,5-1 x 10 ⁶ cellen) aan te passen.
   • Cellen plus PI, dient als een controle om de parameters en poorten (0.5-10 x 10 ⁶ cellen) aan te passen. PI negatieve cellen van deze groep kan ook worden gesorteerd op de cellen fysische eigenschappen.
   • Secundaire alleen (Isotype controle) groep, die tevens als een controle om parameters en poorten (1-2 x 10 ⁶ cellen) te regelen.
   • Immunokleuring groep (8-10 x 10 ⁶ cellen) die wordt gekleurd voor PSA-NCAM te bereikenverdere zuivering van de onrijpe neuronale cellen. Om dode cellen op het sorteren te sluiten, wordt PI toegevoegd aan deze groep.
2. Om immunokleuring start, cellen gecentrifugeerd bij 800 rpm (110 g) gedurende 5 minuten. De supernatant wordt verwijderd en de cellen worden geresuspendeerd in 100 ul volledig medium NSC.
3. Fycoerythrine (PE) geconjugeerd anti-PSA-NCAM antilichaam toegevoegd in een verhouding van 10 pl / 5 tot 10 x 10 ⁶ cellen aan de celsuspensie te gekleurd PSA-NCAM. Op dezelfde wijze wordt een PE geconjugeerd muis IgG 1 isotype controle antilichaam toegevoegd isotypecontrole celsuspensie. Volg de instructies op het antilichaam specificatieblad met betrekking tot de concentratie van antilichaam te gebruiken. De celsuspensie wordt daarna voorzichtig gemengd en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 10-15 min in het donker.
4. De celsuspensies (PSA-NCAM en isotypecontrole buizen) gecentrifugeerd bij 800 rpm (110 g) gedurende 5 minuten, wordt de supernatant verwijderd en de cellen opnieuw suspended in 1 ml compleet NSC medium.
5. Om dan niet-gebonden antilichamen te verwijderen uit de monsters, wordt stap 4 2-3 keer herhaald.
6. Na opnieuw in suspensie cellen in een geschikt volume medium propidiumjodide (PI, Sigma, 500 ug / ml in PBS) toegevoegd in een concentratie van 1 pl / ml van de celsuspensies (cellen plus PI, isotypecontrole en PSA- NCAM-gekleurde monsters) om dode cellen te sluiten bij de analyse door middel van flowcytometrie.
7. 15 ml steriele Falcon buisjes met 1 ml compleet medium bereid zijn om gesorteerde cellen van verschillende celpopulaties te verzamelen.

5. Fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting (FACS) van onrijpe Neuronen

1. De FACS apparaat is ingesteld op basis van de handleiding instructie via de flowcytometrie faciliteit deskundige technicus.
2. Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of een andere passende oplossing depending op instructies van de fabrikant kan worden gebruikt als mantelvloeistof bij 28 PSI door een mondstuk 90 pm.
3. Differentiële druk op het systeem wordt aangepast zodanig dat de soort trigger-tarief niet 2500 events / seconde te overschrijden.
4. De celsuspensie van de cellen alleen groep wordt uitgevoerd door de FACS machine.
5. Eerst worden de cellen (evenementen) uitgezet op basis van hun omvang (Forward Scatter (FSC) licht) versus interne complexiteit (Side Scatter (SSC) licht) om verschillende celpopulaties te onderscheiden. Hiertoe dient spanning parameters FSC en SSC zo worden ingesteld dat de cellen te zien in de flowcytometrie plot.
6. Om cel klonten en wambuizen uit te sluiten, worden de cellen eerst uitgezet op basis van voorwaartse verstrooiing gebied (FSC-A) ten opzichte van voorwaartse verstrooiing pulsbreedte (FSC-W) en de enkele cel bevolking is gated als de bevolking 1 (P1). Dan is de P1 cellen worden uitgezet op basis van zijwaartse verstrooiing gebied (SSC-A) ten opzichte van zijwaartse verstrooiing pulsbreedte (FSC-W) en deze keer van de afzonderlijke cellen zijn gated als de bevolking 2 (P2). Na te hebben vastgesteld die twee opeenvolgende poorten, bosjes of wambuizen (hoge FSC pulsbreedte en hoge SSC pulsbreedte) worden uitgesloten.
7. Om dode of beschadigde cellen uit te sluiten, worden de afzonderlijke cellen (P2) uitgezet op basis van PI reactiviteit ten opzichte van FSC-A en de single live-celpopulatie is omheind.
8. Single levende cellen worden uitgezet op basis van FSC ten opzichte van SSC naar verschillende celpopulaties op basis van celgrootte en de interne granulariteit te onderscheiden. In dit stadium twee celpopulaties zijn gated als ^FSC-lage SSC ^laag (P3) en FSC ^hoge SSC ^hoog (P4) celpopulaties.
9. Om te sorteren PSA-NCAM immuno-reactieve onvolwassen neuronale cellen van het FSC ^lage SSC ^{lage bevolkingsgroei,} eerst de FSC ^lage SSC ^lage populatie van de controle (cellen plus PI en isotype controle) groepen is uitgezet op basis van PE immunoreactiviteit versus FSC-A en de negatieve cellen zijn gated (P5), en dan positieve cellen van PSA-NCAMgebrandschilderde groep zijn gated als de bevolking 6 (P6).
10. Na het afstellen van alle benodigde poorten, worden de cellen van de belangen gesorteerd in 15 ml steriele cultuur buisjes met 1 ml NSC medium.
11. Gesorteerde cellen worden vervolgens gecentrifugeerd bij 1200 rpm (240 g) gedurende 5 minuten.
12. Supernatant wordt verwijderd en de pellet wordt geresuspendeerd in een zodanige hoeveelheid van medium (afhankelijk van de korrelgrootte) en een celgetal uitgevoerd.
13. Cellen worden geplaat bij Poly-L-ornithine bekleed 96-well platen met een dichtheid van 20-30 x 10 ³ cellen / putje in 200-250 ul volledig medium NSC met 5% FCS en 20 ng / ml menselijk recombinant Bmp4 ⁵ .

Opmerking: de laag 96 wells werd 100 ul van poly-L-ornithine werkende oplossing (1,5 ml Poly-O en 8,5 ml steriele PBS) toegevoegd aan elk putje en de plaat geïncubeerd in een 37 ° C incubator gedurende ten minste een uur. Vervolgens wordt de poly-O verwijderd en elk putje wordt driemaal gewassen met steriele PBS(Laat de PBS in de put blijft gedurende 10 minuten per keer). Gebruik 500 ul Poly-L-ornithine werkende oplossing / goed als 24-well platen worden gebruikt.

14. De cellen worden vervolgens vastgesteld op verschillende tijdstippen na sorteren met behulp van koude 4% paraformaldehyde en immunostained passende neuronale en gliale cel markers om het fenotype van gesorteerde cellen van verschillende celpopulaties te beoordelen.

6. Representatieve resultaten

In de neuroblast assay (NBA) differentiatie cultuur, vergulde cellen hechten aan de weefselkweek substraat en te groeien als een monolaag. Afhankelijk van de eerste cel plating dichtheid, zal de cultuur te veranderen in een 90-95% confluente cultuur na 3-4 dagen. In dit stadium kan een monolaag van voornamelijk astrocytic cellen gevisualiseerd onderzijde met ronde neuronale progenitorcellen op ^4,5 (figuur 1). Na het inschakelen de middellange tot een groeifactor vrij medium, neuronale progenitorcellen te beginnendelen snel en genereren clusters van onrijpe cellen neuroblast bovenop de astrocytic monolaag in 4-5 dagen (figuur 2). Flowcytometrie-analyse van gescheiden NBA cultuur op dag 4-5 van de differentiatie fase, toont twee celpopulaties; FSC ^lage SSC ^lage en ^hoge FSC SSC ^hoog op basis van celgrootte (FSC) en interne granulariteit (SSC) (figuur 3). Immuno-fluorescerende analyse van de gesorteerde cellen blijkt dat de neuronale cellen hoofdzakelijk in de FSC ^lage SSC ^lage populaties (meer dan 75% daarvan tot expressie β-III tubuline), terwijl gesorteerde cellen van FSC ^hoge SSC ^{dichtbevolkte} meestal GFAP immunoreactieve astrocyten (figuur 4). Verdere zuivering van onrijpe neuronale cellen tot in de buurt van homogeniteit (97%) kan worden bereikt met een positieve selectie van de PSA-NCAM IR cellen van het ^FSC-lage SSC ^lage bevolking (Figuur3, 4). Verrijkt neuronale cellen gegenereerd uit de NSCs geïsoleerd van E14 muis ganglion eminenties het verwerven van een GABA-erge fenotype en express DARPP-32, een marker van middelgrote stekelige neuronen, op differentiatie (figuur 5).

Figuur 1. Neuroblast test cultuur van E14 muis neurale stamcellen op dag 4 van de proliferatie fase. Dit monolaag cultuur bestaat uit platte astrocytaire cellen (pijlpunten) onder en rond neuronale progenitorcellen (pijlen) op de top. Originele vergroting, 20 x.

. Figuur 2 Neuroblast test cultuur van E14 muis neurale stamcellen op dag 4 van differentiatie fase: A) Fase contrast, B) Immunofluorescente vlekken. Let op de cluster van onrijpe neuronale cellen (pijlen A en β III tubuline kleuring in B) bovenop de astrocytic monolaag (pijlpunten in A, GFAP kleuring in B). Originele vergroting, 20 x.

. Figuur 3 Vertegenwoordiger soort percelen: A). FSC vs SSC soort plot voor de uitsluiting van doubletten en dode cellen. B, C). Sorteer percelen voor de uitsluiting van doubletten op basis van FSC en SSC pulsbreedte. D). Uitsluiting van dode en beschadigde cellen op basis van propidiumjodide immunoreactiviteit. E). FSC vs SSC perceel na uitsluiting van doubletten en dode cellen, die de twee belangrijkste bevolkingsgroepen bestempeld als de FSC ^lage SSC ^laag en het ^FSC-hoge SSC ^hoge populaties. F, G). Sorteer percelen PSA-NCAM IR onrijpe cellen te isoleren van de FSC ^lage SSC ^lage bevolking.

Figuur 4. Vertegenwoordiger microfoto van cellen gesorteerd van verschillende populaties een dag na plating. A) FSC ^lage SSC ^lage bevolking (meer dan 75% van deze cellen neuronen). B) FSC ^hoge SSC ^hoge bevolking (de meerderheid van deze cellen zijn astrocyten ). C) PSA-NCAM ⁺ gesorteerde cellen van FSC ^lage SSC ^lage bevolking (bijna alle van de gesorteerde cellen neuronen). Originele Vergroting, 20 x.

Figuur 5. Gesorteerd onvolwassen neuronen differentiëren tot neuronen GABAergic (A) en express DARPP-32 (B), een marker voor middelgrote stekelige neuronen.

Discussie

De mogelijkheid om bepaalde neurale celpopulaties te isoleren (dat wil zeggen neuronen, astrocyten en oligodendrocyten) kunnen oplossen van enkele van de belemmeringen in verband met de klinische toepassing van neurale stamcellen (NSC). Ten eerste kunnen we het volledig karakteriseren van het begin bevolking van donor cellen. Ten tweede kunnen we een bepaald celtype of een combinatie van verschillende celtypes gebruikt met een specifieke verhouding afhankelijk van de aard of fase van de ziekte. Ten slotte kan het gebrui...

Materialen

Naam van het serum	Type	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
NeuroCult NSC basismedium	Medium	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult NSC Proliferatie Supplementen	Medium supplement	Stem Cell Technologies	05701
% 0,05 trypsine-EDTA	Reagens	Gibco	25300-062
Soja trypsine-remmer	Reagens	Sigma	T6522
Pen / Strep	Reagens	Gibco	15140-122
* MEM	Reagens	Gibco	41500-018	HEM component
* HEPES	Reagens	Sigma	H4034	HEM component
* Gedistilleerd water	Reagens	Gibco	15230-147
Cell zeef	Zeef	BD Falcon	352340
T25 kolf	Cultuur software	Nalge Nunc internationale	136196
T80 kolf	Cultuur software	Nalge Nunc internationale	178905
15 ml buizen	Cultuur software	BD Falcon	352096
50 ml	Cultuur software	BD Falcon	352070
EFG	Groeifactor	R & D	2028-EG
b-FGF	Groeifactor	R & D	3139-FB
Heparine	Groeifactor	Sigma	H4784	Gereconstitueerd in PBS
Anti-PSA-NCAM-PE	Antilichaam	Miltenyi Biotec	130-093-274
PE-geconjugeerde muis IgG1	Isotype controle antilichaam	BD Pharminogen	556029
Heparine	Groeifactor	Sigma	H4784	Gereconstitueerd in PBS
HrBMP-4	Groeifactor	R & D	314-BP-010
Poly-L-OrnitHine	Reagens	Sigma	P4957
Foetaal Calf Serum	Medium Supplement	Gibco	10099-141
GFAP	Antilichaam	DAKO	Z0334
B-III tubuline	Antilichaam	Promega	G7121

* Om HEM, mix 1 x 10 L pakket van MEM en 160 ml 1 M HEPES te maken en breng het volume op 8,75 L met gedestilleerd water. Stel de uiteindelijke pH op 7,4 en het op 4 ° C.