Multiplexed fluorometrische Immunoassay Methodiek en problemen oplossen

Summary

Met behulp van Luminex Corporation xMAP microsfeer technologie, hebben we de multiplexverzending fluorometrische immunoassay (MFIA) voor serologische tests van de verschillende proefdier. De MFIA een suspensie microarray waar antigen, weefselcontrole of immunoglobulinen covalent gekoppeld aan gekleurde polystyreen microsferen. De MFIA testmethode, evenals verschillende onderwerpen voor problemen oplossen is gericht.

Abstract

Om de kwaliteit van diermodellen gebruikt bij biomedisch onderzoek dat we hebben een aantal diagnostische teststrategieën en methoden te bepalen of dieren blootgesteld aan onvoorziene infectieuze agentia (virussen, mycoplasma en andere veeleisende micro-organismen). Infecties van immuuncompetente dieren zijn over het algemeen van voorbijgaande aard, maar toch serumantistofresponsen voor infecties vaak kunnen worden opgespoord binnen enkele dagen tot weken aanhouden en gedurende de gehele levensduur van de gastheer. Serologie is de primaire diagnostische methode waarmee proefdieren worden gecontroleerd. Historisch de indirecte enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is de belangrijkste screeningswerkwijze voor serologische tests. De ELISA wordt uitgevoerd als een singleplex, waarin een microbiële antigen-antilichaam reactie wordt per well gemeten. In vergelijking de MFIA uitgevoerd als een gemultiplexte assay. Aangezien de microsferen zijn in 100 verschillende kleurenschema's kunnen wel 100 verschillende assays worden uitgevoerd simultaaneously in een microplaat goed. Deze innovatie vermindert de hoeveelheid serum, reagentia en disposables vereist voor routinetests terwijl de hoeveelheid van informatie uit een monsterkamer. Daarnaast zijn wij in staat om meerdere interne controle kralen te nemen om te proeven en het systeem geschiktheid te controleren en daarmee zorgen voor de nauwkeurigheid van de resultaten. Deze omvatten weefsel controle en IgG-anti-testserum soorten immunoglobuline (αIg) gecoat parel sets te proeven geschiktheid te evalueren. Zoals in de ELISA en IFA, de weefselcontrole detecteert niet-specifieke binding van serum immunoglobuline. De αIg controle (Serum controle) bevestigt dat serum is toegevoegd en bevat een voldoende immunoglobuline concentratie terwijl de IgG-controle kraal (System Geschiktheid controle), bekleed met serum soorten immunoglobuline, toont aan dat de gelabelde reagentia en Luminex lezer naar behoren functioneren.

Protocol

1. Uitleg van de MFIA Procedure (figuur 1)

1. De MFIA vereist Charles River's antigeen gecoate polystyreen microsferen (kralen), testsera, gelabeld reagentia (BAG, SPE) en buffers (Primary verdunningsmiddel, Assay buffer).
2. De reagentia worden toegevoegd stapsgewijs aan de wells van 96-well filter bodem microtiterplaten.
3. De MFIA wordt uitgevoerd als een heterogene testen betekenis incubaties worden gevolgd door filter-wasstappen om ongebonden bestanddelen verwijderen of serum gemerkte reagentia. Wasoplossing toegevoegd aan putjes verwijderd door afzuigen door goed filter-bottoms, die de korrels behouden.
4. De MFIA testen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (27 ° C + / -2 ° C).
5. Antigeen-antilichaam complexen gevormd tijdens het testserum incubatiestap worden gedetecteerd door incubatie met gebiotinyleerd geit anti-species conjugaten (BAG), gevolgd door R-fycoerythrine-gelabelde streptavidine (SPE).
6. In de assay lezer de kralen passeren een voor een dooreen detector wanneer ze worden blootgesteld aan twee lasers. Een laser wekt de interne kleurstoffen die de kraal de kleur set, wat overeenkomt met een assay identificeren, de andere wekt de fycoerythrine reporter kleurstof gevangen tijdens de test. Een vooraf bepaald aantal kralen per assay worden gelezen en de intensiteit van phycoerythrine fluorescentie wordt als een mediane fluorescentie Index (MFI).

   
   Figuur 1. MFIA Procedure. De xMAP gebaseerde MFIA is een suspensie microarray die kleurgecodeerde polystyreen 5,6 micron kralen om welke antigenen (of controles) covalent gebonden zijn gebruikt. Aangezien de kralen komen in 100 verschillende kleurenschema's kunnen wel 100 verschillende assays worden uitgevoerd in een enkele put Assay stappen uitgevoerd in filter bodem microtiterplaten zodat kralen kunnen worden gewassen door afzuigen op een vacuüm mondstuk. Reacties worden gelezen met de Luminex xMAP 100 fluorometer. De intensiteit van phycoerythrin fluorescentie wordt gerapporteerd als een mediaan fluorescentie-index (MFI)

2. Voordat de slag Let op het volgende:

1. De MFIA kralen zijn lichtgevoelig
   1. Het beperken van de omvang van de rechtstreekse blootstelling aan licht is van cruciaal belang. De normale hoeveelheid licht positie die zich voordoet tijdens routine-testen is aanvaardbaar, maar langdurige blootstelling kan leiden tot fotobleken van de kralen die maken ze onleesbaar door de Assay lezer.
   2. Het is cruciaal voor het succes van de bepaling dat de MFIA beads altijd gewerveld in suspensie en gesonificeerd (10-30 seconden) voorafgaand aan gebruik.
   3. De test lezer verzamelt informatie van enkele kralen alleen. Geaggregeerde kraal clusters kan leiden tot meer lezen keer.

2. Zorg ervoor dat u de test plaat bedekt met de plaat deksel te houden tijdens alle incubatie stappen om verdamping van de meetoplossingen te voorkomen.
3. Persoonlijke beschermingsmiddelen nodig: laboratoriumjas, glOves en oogbescherming moet worden gedragen ten alle tijden tijdens het werken in een laboratorium setting.

3. Reagentia

1. Tabel 1 bevat de meeste materialen die nodig zijn om een ​​eigen laboratorium MFIA stellen. Bijkomende of dubbele items kan noodzakelijk zijn, afhankelijk van uw specifieke behoeften. Houd er rekening mee dat deze inventarisatie reagentia gekocht van Charles River (MFIA kralen, controles en aanvullende reagentia) uitsluit. Verschillende commerciële bronnen van gebiotinyleerde streptavidine conjugaten en gelabeld fycoerytrine beschikbaar. Echter, de reagentia die beschikbaar zijn vanaf Charles River zijn getitreerd tot de optimale signaal geven aan ruis scoor met uw reagentia, met behulp van alternatieve leveranciers of reagens veel wordt niet aanbevolen.

   Tabel 1. CR-RADS maakt gebruik van een bioplex Schorsing Array Reader van BioRad en geautomatiseerde microplaat ring van BioTek. Equivalent instrumentatie is verkrijgbaar bij alternatieve leveranciers.

   Item	Verkoper	Catalogusnummer
   Uitrusting
   Schorsing array-lezer	* BioRad	171-000205
   96-wells microplaat wasmachine	BioTek	ELX50/8FMW
   Ultrasone reiniger / bad	Cole Palmer	EW0884900
   Analoge vortexmenger	VWR	58816-121
   -20 ° C vriezer	Divers
   4 ° C koelkast	Divers
   12-kanaals pipet, 20-200 ul	VWR	83009-718
   Orbital plaat shaker	VWR / Lab-Line	57019-600
   Eenkanaals pipetten, 20-200 ul, met tips	VWR	83009-732
   Eenkanaals pipetten, 2-20 pl, met tips	VWR	83009-726
   Eenkanaals pipetten, 100-1000μl, met tips	VWR	83009-736
   Vacushield vent apparaat	VWR	55095-006
   Vacuum drukpomp	VWR	54908-037
   Vacuümsysteem afvalreservoir	VWR	80200-640
   Disposables
   96-wells polystyreen plaat	Fisher Scientific	14-245-145
   MultiScreen HTS-BV plaat, 1.2μm filter, styreen	Millipore	MSBV N12 50
   15 ml conische buizen (polypropyleen)	Sarstedt	62554.002
   50ml conische buizen (polypropyleen)	Sarstedt	62547.004
   Serum ampullen	Sarstedt	72694.007
   Aluminiumfolie	VWR	89079-068
   1L flessen, steriel	VWR	28199-246
   0.22μm fles-top filters	VWR	28199-307
   Reagens reservoirs (100ml)	VWR	82026-356
   5ml, 10ml, 25ml pipetten voor het afgeven van vloeibare reagentia	VWR
   Reagentia
   PBS, pH 7,4 een BSA, poeder (zakjes)	Sigma	P3813
   Proclin 300	Sigma / Supelco	48912-U
   Ongecoat microsferen	Luminex	gevarieerd op basis van type

4. Bereiding van het reagens

1. Twee buffers nodig zijn voor de procedure MFIA. Primair verdunningsmiddel is bij Charles River en bevat eigendomsinformatie blokkerende middelen afnemen non-specifieke eiwitinteracties. Assay Wash buffer wordt gemaakt op uw locatie met in de handel verkrijgbare reagentia.
2. Assay Wasbuffer: PBS / 1% BSA pH 7,4 is verkrijgbaar als poeder bij Sigma-Aldrich.
   1. Verwijdering van deeltjes door middel van filtratie is van cruciaal belang, omdat deze deeltjes kan leiden tot verstoppingen in de test lezer. Filter de buffer door middel van een 0.2micron fles-top filtereenheid in steriele, geëtiketteerde containers.
   2. BAG en SPE worden verdund tot hun werkconcentratie in 2X Assay buffer Wash. Opmerking: SPE is lichtgevoelig en should een beperkte blootstelling aan licht.

5. Monstervoorbereiding

1. Stel uw testen materialen, reagentia en disposables.
   1. Multi-en single-channel micropipetten en tips
   2. 96-well laag eiwitbinding microtiterplaten (serumverdunningen) en filter-bodemplaten (MFIA assay)
   3. Het afnemen van bloedmonsters op basis van uw standaard procedure. Laat de bloedmonsters om volledig stolt door ze bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten voor centrifugeren en serum verwijderen. Undilute serum moeten kort worden gewerveld om de serumcomponenten vóór de bemonstering te mengen.
   4. De laatste testen verwatering voor de MFIA is 1/50. Het is noodzakelijk om een ​​2X (1/25) monster van testserum maken voor de assay. Verdun de onverdunde testsera door toevoeging van 1 deel serum tot 24 delen MFIA Primaire Diluent. Organisatie van testserum in een 96-well microtiterplaat reduceert de transfer van monsters naar de TESt plaat en wordt sterk aanbevolen.

6. Testplaat Preparation

1. Voorbevochtiging de 96-well plaat Test is nodig voor een goede, zelfs goed evacuatie verzekeren. Zelfs als de gehele plaat wordt niet gebruikt deze stap is in eerste instantie nodig is, zal je niet op latere reagens toe te voegen of buffer wassen om de lege putten.
   1. Sommige laboratoria lopen minder dan een volledige 96-well plaat door afscherming van de niet-gebruikte putten op de testplaat en van plan om deze putten opnieuw te gebruiken op een later tijdstip. We raden het gebruik van deze methode, omdat dit het juiste filtratie van de testplaat beïnvloeden.

2. Juiste testplaat streven is cruciaal voor het succes van de MFIA test. Evacuatie van het monster putten duurt ongeveer 5-10 seconden. Afzuigen van het goed inhoud te snel kan leiden tot aggregatie en bead langzaam gelezen keer aan het eind van de test.
3. Dep de onderzijde van de testplaat met papieren handdoeken na elke was stap om vloeistof drainage te garanderen is gestopt. Als de testplaat blot kan leiden tot vloeibare reagentia uit de bronnen wicking tijdens incubatie en resulteren in gebreke geit anti-soorten en / of soorten IgG kraal scores. Deze kralen zijn bedoeld om score binnen een vooraf bepaald bereik MFI wanneer de juiste hoeveelheid primaire serum en gekenmerkt reagentia aan elk putje toegevoegd.

7. MFIA Bead Schorsing Voorbereiding

1. Het is cruciaal voor het succes van de bepaling dat de kralen altijd gewerveld en gesoniceerd voor gebruik. De test lezer verzamelt informatie van enkele kralen alleen, kan kraal aggregaten of klonten leiden tot meer lezen keer.
2. Vortex de voorraad gekoppeld kraal schorsing (meestal 10 ± 5 seconden)
3. Resuspendeer de kralen gevolgd door sonificatie in een bad sonicator gedurende 10-20 seconden.
4. Verdun de 20X voorraad schorsing van een 2X werken kraal schorsing in het jeugdwerk Diluent. Breng 50 pl van de 2X kraal schorsingaan elk putje van de assay pre-wet testplaat.

8. Toevoeging van test en de controlesera aan de testplaat

1. Pipetteer 50 ul van elk 2X Test en Controle serum om de Test Plate op basis van uw vooraf gedefinieerde bord kaart. Secure deksel op de plaat met een elastische band of aluminiumfolie en incubeer de testplaat van 60 minuten op een rondschudapparaat, in het donker bij kamertemperatuur.
   1. De shaker snelheid moet meer dan 400 en minder dan 700rpm. Het is essentieel dat de korrels worden bewaard in suspensie om serumantilichamen toegang tot alle oppervlakken van de gekoppelde antigenen. Falen om de kralen gesuspendeerd resulteert in lage IgG bead control scores en de assay moet worden herhaald.

9. Het wassen van de testplaat

1. Zuig de inhoud goed met een vacuüm mondstuk. Evacuatie van het monster putten duurt ongeveer 5-10 seconden.
2. Dep de onderkant van de testplaat met paper handdoeken na elke vloeibare drainage te gestopt.
3. Resuspendeer de kralen in 50 pl Assay buffer Wash. Het is belangrijk dat de korrels niet kunnen drogen tijdens het bepalingswerkwijze.

10. Het toevoegen van BAG en SPE op de testplaat

1. Breng 50 pl van 2X werkverdunning BAG om alle putjes die MFIA kralen. Zet het deksel op de plaat met een elastische band of aluminiumfolie. Incubeer de testplaat van 30 minuten onder schudden als hierboven in het donker bij kamertemperatuur.
   1. Na deze incubatie was de testplaat en resuspendeer de kralen met Assay Wash buffer zoals eerder beschreven na serum toevoeging.

2. Breng 50 pl van 2X werkverdunning SPE aan alle putjes die MFIA kralen. Zet het deksel op de plaat met een elastische band of aluminiumfolie. Incubeer de testplaat van 30 minuten onder schudden als hierboven in het donker bij kamertemperatuur.
   1. Na deze incubation Was de testplaat en resuspendeer de kralen met 125μl of Assay Wash buffer en schud de plaat gedurende ~ twee minuten om de korrels mengen voorafgaand aan het plaatsen in de assay lezer.

11. Het lezen van de testplaat

1. Plaats de testplaat in de assay lezer binnen 10 minuten na resuspenderen de kralen. In geval van stroomuitval of een andere gebeurtenis, de testplaat worden bewaard bij kamertemperatuur in het donker tot 12 uur en klaar om te lezen.
   1. Let op de eerste monster goed om te controleren of de geselecteerde kraal paneel de kraal profiel in de test putten past. Als er kralen die buiten hun aangewezen 'kraal regio' op het protocol display verschijnt, is een onjuiste profiel selectie gemaakt.
   2. Wanneer de kralen zijn goed gesuspendeerd moeten invullen in de gespecificeerde 'regio's die in de assay reader software.
   3. Wanneer de kralen zijn samengevoegd zullen vullen in de regio met een lagetarief. U kunt de testplaat van de lezer en handmatig resuspendeer de putten. Tritureer elk putje met een multikanaals pipet 3-4 keer te helpen bij het opbreken van de kraal aggregaten. Vervang de testplaat in de lezer en ga verder.

12. Representatieve resultaten

1. Een minimum aantal korrels per assay worden gelezen en de intensiteit van phycoerythrine fluorescentie wordt als een mediane fluorescentie Index (MFI) tussen 0 en 32.667. Na vergelijking van tellingen van 25, 50 of 100 kralen per putje zagen we geen statistisch verschil en routinematig 25 kralen per agent en tellen per monster. Onderzoek de resultaten rapport voor fouten, zoals onvoldoende kraal telt of falende IgG / anti-IgG kraal scores. Deze kralen zijn bedoeld om "score" binnen een vooraf bepaalde MFI bereik wanneer de juiste hoeveelheid primaire serum en gekenmerkt reagentia aan elk putje toegevoegd. Monsterputjes met fouten, (lage kraal counts) of, bij gebreke IgG controle kraal scores moetenworden herhaald om geldige resultaten te verkrijgen.
2. De resultaten exporteren naar een Excel-werkblad. Voor onze interpretatie van gegevens elke assay is toegewezen:
   1. Een Weefsel Control (TC) Test: Voor de meeste knaagdier MFIA assays, het weefsel controle is een extract van wild-type baculovirus-geïnfecteerde insectencellen.
   2. Een bepaling Cutoff: Deze waarde is de verwachte minimum fluorescentie en aangepast voor elke assay om diagnostische nauwkeurigheid te maximaliseren. Voor de meeste assays, de fluorescentie cutoff 3000.

3. Net mediane fluorescentie Index (MFI) wordt berekend voor elke assay (behalve weefsel en IgG controles) met de volgende formule. Met andere woorden, de specifieke assay signaal het totale assay MFI minus de TC (achtergrond) MFI Deze waarde wordt gedeeld door 1000 die slechts stelt het bereik van Net MFI tussen 0-32 plaats van 0-32,667.
   

   Netto MFI = (MFI _{Antibody Test} - MFI _{weefselcontrole)} / 1000

   Net MFI en TC MFI worden omgezet in scores in vergelijking met het Assay Cutoff specifiek voor elk antigeen.

   

   
   Figuur 2. Vertegenwoordiger MFIA gegevens voor testsera met alle IgG controles passeren.

4. 12,4 MFIA Interpretatie
   1. Testplaat resultaten alleen worden geïnterpreteerd als de systeem-besturing en geschiktheid Serum Control (IgG / anti-IgG beads) resultaten voldoen aan de acceptatiecriteria in tabel 2. Falen van deze twee IgG-controle kralen kan meerdere procedurefouten zoals onjuiste verdunning of onvoldoende volume conjugaat of SPE, verkeerde testserum verdunning of het gebruik van serum van een immunocomprimised dier.

      Tabel 2

      Acceptatiecriteria voor Assay Controls
      Controle	Acceptabel resultaat
      	Partituur	Classificatie
      High Range immuunserum	≥ 4,5	Positief
      Low Range immuunserum	≥ 1,5	≥ Borderline
      Niet-immuunserum	<2,5	≤ Borderline
      Oplosmiddel	<2,5	≤ Borderline
      Ig Bead Set *	≥ Cutoff/1000	Passeren

      * Bead set gecoat met soortspecifieke anti-testserum immunoglobuline (Ig): bij gebreke scores voor dit monster geschiktheid controle zou kunnen voortvloeien uit de toevoeging van onvoldoende monster, een te hoge monsterverdunning, onjuiste soort of het testen van serum van een immunodeficiënte host.

   2. Als een van de Test Plate Assay bedieningselementen niet behalve het hoge bereik immuunserum de resultaten niet aanvaardbaar zijn en moet worden herhaald. Passing Lage tonen Serum controle scores zijn van cruciaal belang, omdat het laat zien de detectie gevoeligheid van de test plaat.
   3. De Goat anti-species IgG bead score is gebaseerd op de hoeveelheid primaire testserum aan de test. Als deze controle niet kraal maar de soort passeert IgG (Well B1, Fig.3) dan betekent dit dat genoeg Reagentia (BAG, SPE) werden toegevoegd aan de monsterkamer en een serum verwante kwestie. Als de hoeveelheid Reagentia onvoldoende is een bijzonder goed zowel IgG en anti-IgG controlekorrels mislukt (Well E1, Fig.3).

      
      Figuur 3. Vertegenwoordiger MFIA testresultaten met storingen (aangegeven in oranje). Wells A1, C1 en F1 duiden op een TC (weefsel reactief) het nietwaar de TC score wordt weergegeven tussen haakjes. Wells B1 en E1 illustreren de twee soorten IgG interne controle storingen onvoldoende testen antilichaam (B1) of reagentia (E1) BAG / SPE respectievelijk.

   4. Als Test plaattest Controle resultaten bevredigend zijn, worden afzonderlijke scores assay ingedeeld zoals weergegeven in tabel 3. Het is van cruciaal belang om een ​​borderline of positieve bevinding te bevestigen door een alternatieve testmethode.

      Tabel 3

      MFIA Score Indeling
      Partituur			Classificatie
      TC	Netto	TC + netto *
      ≥ 2	<0,5	<2,5	Negatieve (-)
      	≥ 0,5	≥ 2,5	TC Reaction (T)
      <2	<1,5		-
      	1,5 ≤ X <2,5		Borderline (B)
      	≥ 2,5		Positieve (+)

      * Een classificatie van negatieve kan nog steeds worden bepaald met een niet-nul mits TC de score van de TC + Netto score (= Ag score) negatief is

Discussion

De MFIA testproces is zeer efficiënt, die minder apparatuur en kleinere monster en reagens volumes dan de traditionele singleplex tests. De functionaliteit van het multiplex systeem geeft de gebruiker de flexibiliteit om gelijktijdig screenen van meerdere serotypen of stammen van gemeenschappelijke middelen in laboratorium-knaagdieren (bijvoorbeeld Coronavirus, parvovirussen etc.). Dit stelt ons voor afgestemde bead panelen ontwerpen gebaseerd op het interessegebied (dwz specifieke virusfamilie) en is aanpasbaar aan screening andere biomoleculen zoals cytokines en andere biomarkers. Daarnaast kunnen we een aantal interne controle assays te nemen om te proeven en het systeem geschiktheid te controleren en daarmee zorgen voor de nauwkeurigheid van de resultaten. Deze omvatten weefsel controle en IgG-anti-testserum soorten immunoglobuline (αIg) gecoat parel sets te proeven geschiktheid te evalueren. Een weefsel controlekorrel detecteert niet-specifieke binding van serum immunoglobuline en αIg bead control bevestigtdat serum is toegevoegd en bevat een voldoende concentratie immunoglobuline. Een andere controle kraal, bekleed met serum soorten immunoglobuline, toont aan dat de gelabelde reagentia en analyse lezer naar behoren functioneren. Andere in de handel verkrijgbare multiplex formaat serologische assays (bijv. microarrays, Immunocomb) mag niet bieden deze hetzelfde niveau van resultaat bevestiging.

De mogelijkheid om een ​​beperking van de mogelijke bron van test falen voorafgaand aan de nacontrole kan helpen een onderzoeker besparen op tijd en materiaal. Kritische aspecten van het MFIA moet worden bevestigd voordat men een mislukte monster. Aangezien de test wordt uitgevoerd bij omgevingstemperatuur moet worden nagegaan of het laboratorium temperatuur ongeveer 27 ° C ± 2 ° C, hogere temperaturen kan leiden tot lager dan verwachte scores voor controles en monsters. Wassen is wellicht de meest kritische stap in de assay. Verzekeren dat de testplaat goed gewassen, afgevloeid en geresuspendeerd kan eliminerende meeste steekproeffouten door lage bead count (door geaggregeerde kralen) of onvoldoende reagens (verloren wicking van testplaat filterbodem). We routinematig tellen 25 kralen per assay (agent) en hebben geen statistisch verschil in de resultaten op te tellen groter aantal kralen die ook leidt tot een langere leestijd voor de plaat.

Wij hebben uitgebreide validatie studies van MFIA op verschillende soorten van de meest gebruikte proefdieren (muis, rat, hamster, cavia en konijn) om diagnostische nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid en robuustheid aan te tonen door het testen van grote aantallen bekende positieve en negatieve serummonsters, en vergelijking van de ELISA, IFA en MFIA resultaten. De detectiegrenzen (bijvoorbeeld standaard immune serum titratie eindpunten) van MFIA waren vergelijkbaar met, en in sommige gevallen overtrof, bij overeenkomstige ELISA. Diagnostische specificiteit, gemeten met SPF knaagdier sera, meer dan 99%, de totale correspondentie between ELISA en MFIA uitgevoerd op bekende positieve en negatieve sera bekende bedroeg meer dan 95%. Kortom, deze resultaten bleek dat multiplex MFIA is een goed alternatief voor de singleplex ELISA, en is geschikt voor het beoogde gebruik, dat wil zeggen in de routine serologische tests van laboratorium dieren kolonies.