Detectie van invasieve pulmonale aspergillose bij hematologische maligniteit Patiënten met behulp van laterale-flow-technologie

Samenvatting

Een snelle en accurate point-of-care test voor invasieve pulmonale aspergillose wordt gepresenteerd. Het maakt gebruik van laterale-flow technologie met een specifiek monoklonaal antilichaam dat bindt aan een Aspergillus Antigeen uitgescheiden tijdens longinfecties. De test is compatibel met serum en brochoalveolar lavage en vertegenwoordigt een nieuwe adjunct-test voor de diagnose van de ziekte.

Samenvatting

Invasieve aspergillose pulmonale (IPA) is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit bij hematologische maligniteit patiënten en hematopoietische stamceltransplantatie afnemers ^1. Detectie van IPA staat voor een enorme diagnostische uitdaging en, bij gebreke van een 'gouden standaard', is gebaseerd op een combinatie van klinische gegevens en de microbiologie en de histopathologie waar mogelijk. De diagnose van IPA moet voldoen aan de Europese Organisatie voor Onderzoek en behandeling van kanker en het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten Mycologie Study Group (EORTC / MSG) consensus definitie van "bewezen", "waarschijnlijk", en "mogelijk" invasieve schimmelinfecties ² . Momenteel zijn er geen op nucleïnezuur gebaseerde tests zijn extern gevalideerd voor IPA-detectie en zo polymerase chain reaction (PCR) is niet opgenomen in de huidige EORTC / MSG diagnostische criteria.

Identificatie van Aspergillus in histologische coupes is problematisch omdat van Simimatigheden in hyphal morfologie met andere invasieve pathogene schimmels ^3, en bewezen identificatie vereist isolatie van de etiologische agent in zuivere cultuur. Cultuur-gebaseerde benaderingen afhankelijk van de beschikbaarheid van biopsiemonsters, maar deze zijn niet altijd toegankelijk bij zieke patiënten, en niet altijd opleveren levensvatbare propagulen voor cultuur wanneer het verkregen.

Een belangrijk kenmerk in de pathogenese van Aspergillus is angio-invasie, een eigenschap die mogelijkheden om de schimmel immunologisch te volgen met behulp van tests die kenmerkende antigene handtekeningen moleculen te detecteren in het serum en bronchoalveolaire lavage (BAL) vocht levert. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van de Platelia enzymimmunoanalyse (GM-mer) die Aspergillus galactomannan en een pan-schimmel 'assay (Fungitell test) dat het geconserveerde schimmel celwandcomponent detecteert (1 → 3)-β-D-detecteert glucan, maar niet in de mucorales deze component in de celwanden ^1,4 ontbreekt. Isklaagt rond de nauwkeurigheid van deze testen ^1,4-6 heeft geleid tot de recente ontwikkeling van de volgende generatie monoklonale antilichaam (Mab)-gebaseerde testen die surrogaat-markers van infectie ^1,5 op te sporen.

Thornton ⁵ Onlangs beschreef het genereren van een Aspergillus-specifieke Mab (JF5) met behulp van hybridoma-technologie en het gebruik van een immuno-chromatografische laterale-flow-apparaat (LFD) voor de point-of-care (POC) diagnose van IPA te ontwikkelen. Een groot voordeel van de LFD is de mogelijkheid om te detecteren, omdat MAb JF5 bindt aan een extracellulair glycoproteïne antigeen dat wordt uitgescheiden tijdens actieve groei van de schimmel slechts ^5. Dit is een belangrijke overweging bij het ​​gebruik van vloeistoffen, zoals long-BAL voor het diagnosticeren van IPA, omdat Aspergillus sporen zijn een gemeenschappelijke component van de ingeademde lucht. Het nut van het apparaat in het diagnosticeren van IPA is aangetoond met behulp van een diermodel van infectie, waar de LFD weergegeven verbeterde gevoeligheid en specificity opzichte van de Platelia GM en Fungitell (1 → 3)-β-D-glucanen assays ^7.

Hier presenteren we een eenvoudige procedure om LFD Aspergillus antigeen te detecteren in menselijk serum en BAL vloeistoffen. De snelheid en nauwkeurigheid biedt een nieuwe adjunct point-of-care test voor de diagnose van het IPA in hematologische maligniteit patiënten.

Protocol

1. Inzameling, opslag en voorbereiding van het serum en bronchoalveolaire lavagevloeistof

1. Verzamelen serum van onbehandelde bloedmonsters doordat bloedstolling bij 4 ° C en opslaan serum als aliquots bij -20 ° C voorafgaande aan gebruik. Bronchoalveolaire lavage vloeistoffen (BAL) moet worden opgeslagen aliquots bij -20 ° C. Let op: Opslag van serum en BAL als aliquots het potentieel voor afbraak van het doelantigeen door herhaaldelijk bevriezen en ontdooien van monsters tijdens de test herhaald beperkt.
2. Ontdooi monsters en meng het serum en BAL monsters door vortexen en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 14.000 rpm.
3. Voor routineonderzoek van humane serummonsters verdunnen serum 1:1 (v / v) met weefselkweekmedium (TCG). TCG uit RPMI-1640 medium, 10% (v / v) foetaal kalf serum, 1% (v / v) van 200 L-glutamine oplossing en natriumazide (0,02% w / v) als conserveermiddel. Het medium wordt bereid vooraf worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende enkele maanden. Breng 100 ul van de diluted serum om de LFD.
4. Voor menselijke BAL vloeistoffen, en voor BAL vloeistoffen uit dierlijke modellen, van toepassing 100 ul nette monster aan de LFD, zonder voorbehandeling.
5. Voor serum van diermodellen verdund serum 1:2 (v / v) met fosfaat gebufferde zoutoplossing bevattende 4% (w / v) EDTA, hitte 3min in een kokend waterbad gedurende 5 min gecentrifugeerd bij 14.000 rpm en toepassing 100 ul supernatant nette de toestel LFD.

2. Toepassing van serum en BAL aan de laterale-flow-apparaat

1. Bewaar de laterale-flow-apparaten bij kamertemperatuur (23 ° C). Bij deze temperatuur inrichtingen stabiel gedurende 12 maanden. Verwijder de apparaten uit het zakken en leg ze op een vlakke ondergrond.
2. Een steriele pipet van toepassing 100 ul voorbehandelde serum of als zodanig BAL monster het vrijkomen poort van de inrichting.
3. Laat de assay uitgevoerd gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, waarna de resultaten van de tests worden geregistreerd. Let op: Binnen enkele seconden de vloeistof zal zijn seen tot migratie door capillaire werking langs de nitrocellulose membraan in het kijkvenster.

3. Opnemen en interpreteren LFD resultaten

1. De LFD bestaat uit een interne controle lijn (aangegeven met de letter C op het kunststof) en een test lijn (aangegeven met de letter T). De controle regel moet altijd, ongeacht van Aspergillus antigeen in het serum of BAL monster. Dit toont aan dat de test correct is uitgevoerd.
2. Als de Aspergillus antigeen aanwezig is in het serum of BAL monster, zal de test lijn verschijnen ook binnen 15 minuten van het monster applicatie. Omdat de intensiteit van de test lijn is evenredig met de hoeveelheid van Aspergillus antigeen in het monster, de test lijn kan worden weergegeven als een zwak positief (+), een gematigd positief (+ +) of een sterk positief (+ + +) . Echter, een positieve controle lijn, ongeacht intensiteit zou de aanwezigheid van Aspergillus antigeen in het monster. In ee afwezigheid van Aspergillus antigeen worden geen testlijn verschijnen, en het resultaat wordt als negatief (-).

4. Representatieve resultaten

Representatieve voorbeelden van negatieve zwak positief matige positief en sterke positieve LFD resultaten BAL en serummonsters worden in figuur 1.

Resultaten van antigeen-positieve LFD tests (sterke en zwakke) of negatief LFD proeven met BAL vloeistoffen van acute myeloïde leukemie (AML) patiënten die gediagnosticeerd volgens EORTC / MSG diagnostische criteria worden getoond in Tabel 1. Inbegrepen in deze tabel zijn de bijbehorende klinische en mycologische (galactomannan en cultuur) gegevens en resultaten van een Aspergillus-specifieke PCR-test ontwikkeld aan de St. Bartholomews Ziekenhuis ^8, voor elke patiënt. De diagnose van de ziekte is gebaseerd op gastheer factoren (neutropenie, langdurig gebruik van corticosteroïden, de behandeling met andere erkende T-cel immunosuppressants), klinische criteria en GM positiviteit voor de BAL (hier gedefinieerd als een GM-index waarde> 0,8). Onder de 2002 EORTC / MSG richtlijnen ^10, patiënten van 12, 13 en 16 werden gediagnosticeerd met 'mogelijk' IA op basis van de gastheer factoren en klinische criteria of GM positiviteit. Volgens de herziene (2008) EORTC / MSG richtsnoeren ^2, gastheer factoren en GM positiviteit alleen of gastheer factoren en klinische criteria alleen niet geven 'mogelijk' invasieve schimmelinfectie, tenzij vergezeld van bewijsstukken van de klinische gegevens en mycologie respectievelijk. Patiënt 6 werd gediagnosticeerd met 'waarschijnlijk' IA onder zowel 2002 en 2008 richtlijnen als gevolg van gastheer factoren, grote en kleine klinische kenmerken en GM positiviteit. Let op, dat terwijl noch de LFD of PCR-testen worden op dit moment opgenomen in EORTC / MSG richtlijnen, is er een sterke overeenkomst tussen de twee assays en de commerciële galactomannan-test wijst op de aanwezigheid van Aspergillus antigeen en nucleïnezuur in de BAL-monster s patiënten 6 en 12. Bijkomende resultaten van de proeven tonen de effectiviteit van de LFD en PCR assays diagnose IPA vindt in Johnson et al. ^8.

Figuur 1. Negatieve (controle lijn) en positieve (controle en test lijn) resultaten van LFD tests met het serum en BAL. De intensiteit van de testlijn reacties zijn evenredig met de concentraties van de doel-antigeen in het serum en BAL monsters. Reacties typisch variëren van zwak (+) door matig (+ +) aan sterke (+ + +). Ongeacht testlijn intensiteit zou drie serum positieve reacties vermeld invasieve pulmonale ziekte aspergillose door de aanwezigheid van circulerende Aspergillus antigeen in de bloedstroom. Positieve BAL reacties (zwak, matig of sterk) zou wijzen op ontkieming van sporen en de ontwikkeling van potentieel pathogene hyfen in de longen.

pdflinebreak ">

Patiënt niet.	PatiENT informatie	Klinische criteria 1	BAL cultuur 2	GM MER-index 3	EORTC / MSG (2002) 4	EORTC / MSG (2008) 5	Aspergillus PCR-resultaat	LFD resultaat
6	-	Major CT tekenen (nodule en halo) en een kleine	Negatief	0,9 (positief)	Waarschijnlijk	Waarschijnlijk	Positief	Zwak positief (+)
12	Verondersteld vorige schimmelinfectie	Geen grote, een kleine	Candida glabrata	6,43 (sterk positief)	Mogelijk	Geen	Positief	Sterk positief (+ + +)
13	Coagulase-negatieve stafylokokylococcus en E. coli in bloed	Geen grote, twee kleine	Negatief	0,25 (negatief)	Mogelijk	Geen	Negatief	Negatieve (-)
16	Borst infectie	3 minder belangrijke criteria, waaronder nieuwe infiltreren plus meervoud effusie	Negatief	0,16 (negatief)	Mogelijk	Geen	Negatief	Negatieve (-)

¹ knobbeltjes of halo's op een CT-scan is suggestief voor schimmelinfectie
² Candida glabrata in BAL-vloeistof zou worden beschouwd als zijnde een verontreiniging als het is de tweede meest voorkomende geïsoleerde gist, als onderdeel van de normale menselijke flora ^9
3 Een index van> 0,8 in de GM EIA-test van de BAL is een indicatie van Aspergillus-infectie
⁴ Gebaseerd op de 2002 EORTC / MSG diagnostische criteria voor 'mogelijk te bedienene ',' waarschijnlijk 'of' bewezen 'invasieve schimmelziekte ^10
5 Op basis van de herziene (2008) EORTC / MSG diagnostische criteria voor 'mogelijk', 'waarschijnlijk' of 'bewezen' invasieve schimmelziekte ²

Tabel 1. Resultaten van LFD tests van BAL monsters van acute myeloïde leukemie patiënten met een waarschijnlijke IPA en van de controle AML patiënten (geen bewijs van infectie), en de EORTC / MSG diagnose van de infectie.

Discussie

De definitieve identificatie van IPA kan pas echt worden bereikt door isolatie van de etiologische middel van biopsie monsters, maar het herstel van monsters die is vaak niet mogelijk bij erg zieke patiënten en Aspergillus is zelden vergoeding in aanmerking komen uit het bloed. Terwijl de grote vooruitgang geboekt in het gebruik van de berekende tomografische het scannen van de kist in IPA diagnose, kenmerken die wijzen op pulmonale IPA zoals het "halo" of "air-halve maan" tekenen zijn of van voorbijgaande aard of kunnen worden toegeschreven aan de ademhaling artefacten of schimmelinfecties ^11,12. Deze gegevens worden daarom aangevuld met serologische technieken die gericht zijn op handtekening moleculen (GM-en β-glucan) identificeren van schimmels die circuleren in het serum van de patiënt of die aanwezig zijn in BAL vocht, sputum of urinemonsters ^13. Hoewel deze tests weer te geven voldoende gevoeligheid, zij niet over voldoende specificiteit of last heeft van interferentie onder bepaalde voorwaarden ^1,6 .

De LFD-test voor detectie IPA hier gepresenteerde kan de 'point-of-care' diagnostiek van IPA en exploits technologie die is gebruikt om in tests op heden voor de detectie van virussen, bacteriën, parasieten en toxines ^14-19 en, zoals bekend, voor het huis zwangerschap test voor het eerst geïntroduceerd door Unipath in 1988. In de Aspergillus LFD hier beschreven, wordt de Aspergillus-specifieke MAb JF5 geïmmobiliseerd op een opname zone (de test lijn) op een poreuze nitrocellulose membraan. Anti-muis immunoglobuline geïmmobiliseerd op het membraan in een aparte zone diende als een interne controle (controlelijn). Bij toevoeging van serum of BAS vloeistof de introductie poort MAb JF5-conjugaat in het vrijkomen pad bindt aan het doelantigeen en complexer dan passeert langs het poreuze membraan door capillaire werking. MAb JF5 geïmmobiliseerd in de vangst zone bindt aan de JF5-colloïdaal goud-antigen complex met als gevolg een rode testlijn. Elke niet-gebonden JF5-colloïdaal goudconjugaat bindt aan de interne controle te geven dat de test correct is uitgevoerd. Dit resulteert in een rode stuurleiding.

De test is snel, het nemen van slechts 15 minuten uit te voeren, is goedkoop in vergelijking met serum en BAL tests op basis van GM en de β-glucan detectie, en vereist geen dure apparatuur of uitgebreide laboratoriumfaciliteiten te lopen. Bovendien heeft MAb JF5 geen kruisreactie met de drugs of verontreinigende stoffen waarvan is aangetoond dat tot vals-positieve reactie in de GM-en β-glucan testen ^1,4,6 veroorzaken. Een bijkomend groot voordeel ten opzichte van de huidige diagnostische tests is de LFDs mogelijkheid om activiteiten die een indicatie van invasieve groei van Aspergillus soorten op te sporen.

Een kritische stap in de LFD procedure is de noodzaak om te lezen van de resultaten 15 min na het aanbrengen van het serum of BAL monster naar het apparaat. De test moet niet langer dan 15 min voor het opnemen van de resultaten, omdat dit een vertekend beeld van resultaat interpretatiop. Een zwakke reacties niet worden versterkt door verlenging van de incubatietijd. Warmtebehandeling van serum van diermodellen van infectie is gebleken testgevoeligheid verbeteren. Een beperking van de test is dat het kwalitatief is, en is afhankelijk van de operator om een ​​subjectieve beoordeling van positiviteit te maken. De intensiteit van de test lijn afhankelijk van het antigeen inhoud van serum en BAL monsters (figuur 1). Echter, een positieve reactie (bepaald in vergelijking met bekende negatieven) geeft de aanwezigheid van Aspergillus antigeen en derhalve infectie. Om de subjectiviteit van LFD testen te beperken, hand-held apparaten beschikbaar die het mogelijk maken kwantificering van LFD testlijn intensiteiten en kan de vaststelling van drempelwaarden voor antigeendetectie ^20.

Toekomstige ontwikkelingen van de LFD zijn onder meer de commercialisering en de ontwikkeling van een multiplex LFD dat simultane detectie van andere invasieve pathogene schimmels kunnenmet zeer specifieke MAbs ^3.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
Aspergillus LFD	Universiteit van Exeter		Verkrijgbaar bij de corresponderende auteur op aanvraag
RPMI-1640	Sigma	R0883
L-Glutamine	Sigma	G7513
Foetaal kalf serum	Biosera	S9100	Andere bronnen van foetaal kalfsserum worden gebruikt bij de bereiding van TCG
EDTA	Fisher Scientific	BPE120-1