Quantitative Imaging van Lineage-specifieke Toll-like receptor-gemedieerde signalisatie in monocyten en dendritische cellen van de kleine monsters van menselijk bloed

Summary

We beschrijven het gebruik van ImageStream technologie ( Www.amnis.com), Die een combinatie van kwantitatieve flowcytometrie met gelijktijdige hoge-resolutie digitale beeldbewerking, te kwantificeren cellulaire mechanismen van primaire immuun cellen van goed gedefinieerde patiënten cohorten. Onze studies geven een blauwdruk voor translationeel onderzoek naar lineage specifieke cellulaire respons in kleine steekproeven kwantificeren van onder cohorten.

Abstract

Individuele variaties in het immuunsysteem van status te bepalen reacties op infectie en bij te dragen tot ernst van de ziekte en het resultaat. Veroudering gaat gepaard met een verhoogde gevoeligheid voor virale en bacteriële infecties en verminderde gevoeligheid voor vaccins met een goed gedocumenteerde daling van de humorale en cellulaire immuunrespons ^1,2. We hebben onlangs onderzocht de effecten van de vergrijzing op de Toll-like receptoren (TLR), de belangrijkste componenten van het aangeboren immuunsysteem dat microbiële besmetting en trekker antimicrobiële afweer reacties ³ op te sporen. In een groot cohort van gezonde donoren, hebben we aangetoond dat perifere bloed monocyten van de ouderen hebben expressie en functie van bepaalde TLR ⁴ en soortgelijke verminderde TLR niveaus en signalering reacties in dendritische cellen (DC's) is gedaald, antigeen-presenterende cellen die cruciaal zijn in het verband tussen aangeboren en adaptieve immuniteit ^5. We hebben aangetoond ontregeling van TLR3 in macrofagen eend een lagere productie van IFN door DCs van ouderen donoren in reactie op infectie met het West Nile virus ^6,7.

Paramount aan ons begrip van immunosenescence en therapeutische interventie is een gedetailleerd inzicht in specifieke celtypes reageert en het mechanisme (s) van signaaltransductie. Traditionele studies van immuunresponsen door middel van beeldvorming van primaire cellen en landmeetkundige cel markers door FACS of immunoblot gevorderd ons begrip significant, echter, deze studies over het algemeen zijn technisch beperkt door de kleine steekproef beschikbare volume van patiënten en het onvermogen om complexe laboratorium technieken uit te voeren op meerdere menselijke monsters. ImageStream combineert kwantitatieve flowcytometrie met gelijktijdige hoge-resolutie digitale beeldbewerking en dus vergemakkelijkt onderzoek in meerdere celpopulaties gelijktijdig voor een efficiënte opname van de patiënt gevoeligheid. Hier laten we zien het gebruik van ImageStream in de ontwikkelingslanden te beoordelen TLR7 / 8activatie-gemedieerde toename van fosforylering en nucleaire translocatie van een belangrijke transcriptiefactor NF-kB, die de transcriptie van vele genen die essentieel zijn voor de immuunrespons ⁸ initieert. Met behulp van deze technologie, hebben we onlangs ook blijk gegeven van een eerder opgenomen wijziging van TLR5 signalering en de NF-kB route in monocyten van oudere donoren die kunnen bijdragen aan veranderde immuunrespons bij veroudering ^9.

Protocol

1. Isolatie en stimuleren van immuuncellen

1. Zorg voor 10-50 ml heparine bloed van gezonde vrijwilligers na schriftelijke toestemming volgens de richtlijnen van de lokale Institutional Review Board. Voor studies van het ouder worden of ziekte pathogenese, uitsluiting en insluiting criteria voor elke vrijwilliger of patiënt moet expliciet worden bepaald.
2. Isoleer de humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's) met behulp van CPT-buisjes of Ficoll-Paque Plus volgens de instructies van de fabrikant (GE Healthcare, NJ) en gedrag experimenten op de dag van de isolatie ⁷ (reagentia, tabel 1).
3. Incubeer PBMCs....

Discussion

De kritische stappen in het gebruik van ImageStream voor translationeel onderzoek is de selectie van relevante vergelijking groepen en optimalisatie en validatie van antilichaamspecificiteit. Verschillen tussen subject groepen in het gemerkte doel zal snel duidelijk zijn via histogrammen en mobiele beelden. In combinatie met een grondige analyse van wijzigingen in relevante receptoren en signaalwegen, zullen deze gegevens een waardevol inzicht verschaffen in mechanismen die immuun ontregeling ten grondslag liggen in ges.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
R848	Invivogen	tlrl-r848
Paraformaldehyde (16%)	Elektronen Microscopie Wetenschappen	15710
BD Perm / Wash	BD Biosciences	554723
CD14-PE	eBioscience	12-0149-41
CD4-PacBlue	BD Pharmingen	68436
Lineage cocktail 1 (lin 1)-FITC	BD Biosciences	340546
CD11c-PE	BD Biosciences	347637
CD123-PE	BD Biosciences	340545
konijn anti-NF-kB (p65)	Santacruz	SC-372
Alexa647 F (ab ') 2 geit anti-konijn IgG	Invitrogen	A21246
DAPI	Invitrogen	D21490
ImageStream X	Amnis

Celtype	FITC	PE	Alexa 647	PacBlue
Monocyt		CD14	NF-kB (p65)
mDC	Lin1	CD11c	NF-kB (p65)	CD4
pDC	Lin1	CD123	NF-kB (p65)	CD4