TransFLP - Een methode om genetisch te modificeren Vibrio cholerae Op basis van Natural Transformation en FLP-recombinatie

Samenvatting

Een snelle methode om het genoom ervan te wijzigen V. cholerae Beschreven. Deze aanpassingen behoort het schrappen van enkele genen, gen clusters en genomische eilanden en de integratie van de korte sequenties (bijv. promotor elementen of affiniteit-tag sequenties). De methode is gebaseerd op het natuurlijke transformatie en FLP-recombinatie.

Samenvatting

Verschillende werkwijzen zijn beschikbaar voor manipuleren bacteriële chromosomen ^1-3. De meeste van deze protocollen gebaseerd op het inbrengen van conditioneel replicerende plasmiden (bijv. herbergen pir-afhankelijke of temperatuurgevoelige replicons ^1,2). Deze plasmiden geïntegreerd in bacteriële chromosomen basis van homologie-gemedieerde recombinatie. Dergelijke insertie mutanten zijn vaak direct gebruikt in experimentele settings. Als alternatief kan selectie voor plasmide excisie gevolgd door het verlies worden uitgevoerd, die voor Gram-negatieve bacteriën berusten vaak op de teller instelbare levansucrase enzym gecodeerd door het sacB gen ^4. De excisie kan herstellen vóór het inbrengen genotype of resulteren in een uitwisseling tussen het chromosoom en het plasmide-gecodeerde kopie van het gemodificeerde gen. Een nadeel van deze techniek is dat het tijdrovend. Het plasmide moet eerst worden gekloneerd, het vereist horizontale overdracht V. cholerae (n meeste otably door paring met een E. coli donor stam) of kunstmatige transformatie van de laatste, en de excisie van het plasmide is willekeurig en kan het herstel van de oorspronkelijke genotype of maak de gewenste wijzigingen als er geen positieve selectie wordt uitgeoefend. Hier geven we een werkwijze voor snelle manipulatie van de V. cholerae chromosoom (en) ⁵ (figuur 1). Deze TransFLP methode is gebaseerd op de recent ontdekte chitine-gemedieerde inductie van natuurlijke deskundigheid op dit organisme ⁶ en andere representatieve van het geslacht Vibrio zoals V. fischeri ^7. Natuurlijke competentie maakt de opname van vrij DNA waaronder PCR-gegenereerde DNA-fragmenten. Eenmaal opgenomen, de DNA recombineert met het chromosoom gezien de aanwezigheid van een minimum van 250-500 bp flankerend homoloog gebied ^8. Inclusief een selectiemerker in-tussen deze flankerende gebieden maakt een eenvoudige detectie van veel voorkomende transformanten. t "> Deze methode kan worden gebruikt voor verschillende genetische manipulatie van V. cholerae en mogelijk ook andere natuurlijk competente bacteriën. We geven drie nieuwe voorbeelden van wat kan worden bereikt door deze methode naast onze eerder gepubliceerde studie in enige gendeleties en de toevoeging van affiniteit-tag sequenties ^5. Verschillende optimalisatie stappen met betrekking tot de initiële protocol van chitine-geïnduceerde natuurlijke transformatie ⁶ zijn opgenomen in dit TransFLP protocol. Hieronder vallen onder andere de vervanging van krab schelp fragmenten door in de handel verkrijgbare chitine vlokken ^8, de donatie van PCR afgeleide DNA omzetmaterialen ⁹ en de toevoeging van FLP-recombinatie doelplaatsen (FRT) ^5. FRT er rekening plaatsgerichte excisie van de selectiemerker gemedieerd door de Flp recombinase ^10.

Protocol

De TransFLP methode (figuur 1) wordt geïllustreerd door drie verschillende benaderingen: I) het schrappen van twee aangrenzende genen die coderen virulentiedeterminanten van V. cholerae (bijvoorbeeld ΔctxAB), II) het verwijderen van een eiland pathogeniteit (bijvoorbeeld ΔVPI-1) en III) de integratie van een T7 RNA polymerase promoter-afhankelijke sequentie stroomopwaarts van een gen van belang, dat vervolgens kan de kunstmatige expressie in de respectieve stam achtergrond (bijvoorbeeld T7-TFox) (Figuur 2).

1. Voorbereiding van Chitine Flakes

1. 50-80 mg gewicht van chitine vlokken in een standaard 1,5 ml plastic buis. Dit kan worden bereid in bulk. Chitine vlokken zijn commercieel verkrijgbaar bij Sigma (cat. nummer C9213).
2. Autoclaveren de vlokken houden de deksels van de buizen open.
3. Onmiddellijk sluit de deksels na de autoclaaf is afgekoeld.
4. Store geautoclaveerd chitine vlokkenbij kamertemperatuur.

2. Optioneel: Kunstmatige Transformatie van V. cholerae met FLP recombinase coderende Plasmide

1. Bereid elektrocompetente V. cholerae cellen met standaard methoden ^11. Opslaan van competente cellen aliquots bij -80 ° C.
2. Voeg 1-2 ul van een vaste mini-bereiding van plasmide pBR-flp ⁵ bij de elektrocompetente V. cholerae cellen en breng het mengsel in een elektroporatie cuvette (0,2 cm tussenruimte).
3. Breng een puls op 1,6 kV.
4. Voeg 0,9 ml SOC-medium, zacht overdracht cel om een ​​standaard 14 ml buis. Incubeer stilstaande gedurende 2,5 tot 3 uur bij 30 ° C.
5. Plaat 100 pl en 300 pl op LB-platen met 100 ug / ml ampicilline en incubeer bij 30 ° C geroerd.
6. Zuiver enkele kloon en op te slaan als glycerol voorraad voor levering de toekomst TransFLP experimenten.

3. Oligonucleotide Ontwerp en Polymerase Chain Reaction

1. Ten minste zes oligonucleotiden moeten de DNA regio (s) van belang en de FRT-geflankeerd antibioticum cassette door PCR (Figuur 3) te amplificeren. Het verdient aanbeveling om ook een paar oligonucleotiden priming buiten geplaatst PCR fragment. Hierdoor kan controleren op correcte integratie en excisie van de FRT-geflankeerd antibioticaresistentie cassette (bijvoorbeeld weergegeven als "CHK-up" en "CHK-down 'primers in de figuren 3 tot 5).
2. Ontwerp oligonucleotiden # 2, # 3, # 4 en # 5 met zorg. Zij moeten in staat zijn voldoende (bijvoorbeeld ~ 28 bp) hybridiseren aan het matrijs-DNA. De template DNA genomisch DNA (gDNA) van primers # 2 en # 5 en FRT-Kan-FRT-bevattende plasmide DNA zoals pROD17 ¹² en pBR-FRT-KAN-FRT (dit onderzoek) voor primers # 3 en # 4 ( figuur 3A).
3. Ontwerp de primers # 2 # 5 waardoor uitgebreide basenparing aan hun 5'-uiteinde van # 2 / # 3 en # 4 / # 5, respectievelijk (Figuur 3A inzet). Twee ronden van PCR volgen.
4. Voer drie onafhankelijke PCR reacties als ^1e ronde van PCR. De eerste zal versterken het stroomopwaartse gebied van het gen / DNA regio-of-interest met behulp van oligonucleotiden # 1 en # 2. De PCR moet resulteren in een fragment van ten minste 500 bp in lengte homologe recombinatie mogelijk is binnen de cellen. Kortere fragmenten (~ 250 bp) kan volstaan ^​​8 maar worden niet aanbevolen.
5. Parallel uitvoeren van de tweede PCR, die de FRT-geflankeerd antibiotica cassette versterkt. Voor de voorbeelden die we hier vooral gebruikt aph (kan ^R). Gebruik oligonucleotiden # 3 en # 4 voor deze reactie (Figuur 3A).
6. Daarmee samenhangend versterken de stroomafwaartse DNA-regio door middel van PCR (derde monster). Het PCR fragment moet ook ten minste 500 bp in lengte. De PCR met gDNA als template en oligonucleotiden # 5 en # 6 (Figuur 3A).
7. Na zuivering van de drie PCRfragmenten Voer de ^2e ronde van PCR. Gebruik een gelijk mengsel van alle drie fragmenten verkregen in de eerste ronde als template. De amplificatie wordt gekatalyseerd door oligonucleotiden # 1 en # 6. Het verkregen PCR fragment (Figuur 3B) dient als transformerende DNA in de natuurlijke transformatie experiment (figuur 1).

4. Chitine-geïnduceerde Natural Transformation

1. Grow V. cholerae cellen aëroob in rijk medium bij 30 ° C totdat zij een optische dichtheid bereiken bij 600 nm van ongeveer 0,5.
2. Oogst de bacteriën door centrifugatie. Was de pellet in gedefinieerde kunstmatig medium (DASW ⁶⁾ voordat resuspenderen de cellen in 2 delen DASW. Voeg 1 ml van cultuur aan 50 tot 80 mg steriele chitine vlokken (onder punt 1). Als bacteriën haven plasmide pBR-flp (optioneel punt 2), add ampicilline (50 ug / ml) aan de kweek. Incubeer bij 30 ° C gedurende 16-24 uur zonder beweging.
3. Voeg & ge, 200 ng van de 2 ^e-round PCR-afgeleide fragment (onder punt 3). Meng voorzichtig, zonder uitgebreid verwijderen van de bacteriën uit de chitine oppervlakken. Incubeer bij 30 ° C gedurende 24 uur zonder beweging.
4. Vortex de cultuur uitgebreid voor ≥ 30 sec. Verspreid 1-300 ul op selectieve LB-medium platen (bijv. kanamycine of gentamicine-bevattende LB-platen voor voorbeelden hier aanwezig). Gebruik dubbele selectieve platen als de bacterie herbergen het plasmide pBR-flp door het toevoegen van ampicilline gelijktijdig aan de andere antibiotica. Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 16-24 uur of totdat kolonies zichtbaar.
5. Isoleer enkele transformanten van selectieve platen. Dergelijke transformanten zijn vervangen door de oorspronkelijke chromosomale locus door PCR fragment door een dubbele crossover event. Deze stammen kunnen direct worden gebruikt voor verdere experimenten bij de verwijdering van het antibioticum cassette niet nodig.

5. Verwijdering van Selectieve Cassette (s) door Flp-Recombinatie

1. Kunstmatig transformeren uw transformanten met plasmide pBR-flp zoals beschreven onder punt 2 indien niet gedaan voordat de natuurlijke transformatie test.
2. De bacteriën groeien op LB-agarplaten met ampicilline bij 37 ° C gedurende 16-24 uur. Opties: verandering in de temperatuur tussen 2-3 uur tot 40 ° C als expressie van flp van plasmide pBR-flp is de-onderdrukt bij hogere temperaturen ^5,10; overdracht bacteriën verse platen na ca. 8 uur incubatie.
3. Test voor antibiotica-gevoeligheid (hier aangetoond voor kanamycine, figuur 1) door restreaking de klonen in parallel op antibiotica-bevattende en antibiotica vrij agarplaten. Isoleer enkele gevoelige kolonies. Freeze ampicilline-resistente kloon als glycerol voorraad als u van plan verder wijzigen van de stam met andere schrapping / invoegen met behulp van TransFLP.

6. Plasmide Curing

1. Een dag te behalen cultuur onder aërobe conditie enbij 30 ° C. Gebruik rijk medium zonder de toevoeging van een antibioticum.
2. Optioneel: Grow verse cultuur voor 3-6 uur door verdunning van de kweek van een nacht 1:100 in verse antibiotica-vrij medium.
3. Plaat of strook verdunning (s) van de cultuur op gewoon LB-agar plaat (platen) en incubeer bij 30 ° C gedurende 8-16 uur (tot kolonies zichtbaar zijn).
4. Test voor ampicilline-gevoeligheid van de klonen door restreaking de klonen in parallel op antibiotica-bevattende en antibiotica vrij agarplaten (figuur 1). Freeze ampicilline-gevoelige stam als glycerol voorraad.

Resultaten

Representatieve resultaten van de drie voorbeelden worden getoond in figuren 4 tot 6. De eerste benadering die gericht zijn op het verwijderen van de naburige genen ctxA en ctxB. Samen coderen belangrijke virulentiefactor van V. cholerae choleratoxine. We ontwierpen oligonucleotiden voor de TransFLP werkwijze zoals boven beschreven en volgens figuur 3. De parentale stam, werden de tussenliggende stam die de FRT-geflankeerd antibioticaresistentie cassette in de...

Discussie

De TransFLP hierboven beschreven werkwijze en elders ⁵ veelvuldig gebruikt in ons laboratorium. Het soort genetische manipulaties die haalbaar zijn onder andere: deletie van enkele genen en clusters, deletie van genomische eilanden (bijv. VPI-1), insertie van sequenties stroomopwaarts van een gen van belang (bijvoorbeeld, promotersequenties) en insertie van sequenties aan het einde van een specifiek gen (bijvoorbeeld coderend affinity tags).

Een import v...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
Chitine vlokken	Sigma	C9213	Autoclaveren nodig
OPTIONEEL: Micropulser (in het geval antibiotica cassette moet worden uitgesneden door Flp recombinase gecodeerd op pBR-flp)	Biorad	165-2100	Of vergelijkbare electroporators