Toezicht op de reductieve en oxidatieve Half-reacties van een Flavin-afhankelijke mono-oxygenase met Gestopt-Flow Spectrofotometrie

Summary

Wij beschrijven het gebruik van een gestopt-flow instrument zowel de reductieve en oxidatieve halve reacties van onderzoeken Aspergillus fumigatus Siderofoor A (Sida), een flavine-afhankelijke mono-oxygenase. Vervolgens hebben we laten zien de spectra die overeenkomt met de soort in de reactie van SIDA en berekenen we de snelheidsconstanten voor hun vorming.

Abstract

Aspergillus fumigatus siderophore A (SIDA) een FAD bevattende monooxygenase de hydroxylering van ornithine katalyseert in de biosynthese van hydroxamaat sideroforen die essentieel zijn voor virulentie (bijv. ferricrocin of N ', N ", N'''-triacetylfusarinine C) ^1. De reactie gekatalyseerd door Sida kan worden onderverdeeld in reductieve en oxidatieve halve reacties (Schema 1). reductieve halve reactie, de geoxideerde FAD gebonden aan een f SIDA, verminderd met NADPH ^2,3. In de oxidatieve halfreactie de verminderde cofactor reageert met moleculaire zuurstof bij een C4a-hydroperoxyflavin tussenproduct, waarin een zuurstofatoom overdraagt ​​aan ornithine te vormen. Hier wordt een procedure voor het meten en percentages detecteren verschillende spectrale vormen Sida met een onderbroken flow instrument geïnstalleerd beschrijven anaerobe handschoenkast. In gestopt-flow instrument kleine hoeveelheden reagentia snel gemengd en nadat de stroom is gestopt the stop injectiespuit (figuur 1) zijn de spectrale veranderingen van de oplossing geplaatst in de waarneming cel opgenomen in de tijd. In het eerste deel van het experiment laten we zien hoe we de stoppen-flow instrument te gebruiken in single mode, waar de anaerobe reductie van de flavine in A f Sida door NADPH direct wordt gemeten. Vervolgens gebruiken we dubbele mengen instellingen waarbij A f Sida wordt eerst anaëroob door NADPH verminderd voor een bepaalde periode van tijd in een vergrijzende lus, en dan reageerde met moleculaire zuurstof in de observatie cel (figuur 1). Om dit experiment uit te voeren, anaërobe buffers zijn nodig omdat, wanneer alleen de reductieve halve reactie wordt gedetecteerd, zuurstof in de oplossingen reageren met de verminderde flavine cofactor en vormen een C4a-hydroperoxyflavin tussenproduct dat uiteindelijk weer oplossen in het geoxideerde flavine . Dit zou niet toestaan ​​dat de gebruiker toe om nauwkeurig te meten verlagingspercentages want dan zou het volledige omzet van de Enz te zijnYME. Bij de oxidatieve halve reactie wordt onderzocht het enzym worden verminderd in afwezigheid van zuurstof, zodat slechts de stappen tussen reductie en oxidatie worden waargenomen. Een van de buffers die in dit experiment is zuurstof verzadigd is, zodat we de oxidatieve half-reactie te studeren aan hogere concentraties van zuurstof. Dit zijn vaak de procedures uitgevoerd bij het bestuderen van zowel de reductieve of oxidatieve half-reacties met flavine-bevattend monooxygenases. De tijdschaal van de pre-steady-state experimenten uitgevoerd met de gestopt-flow is milliseconden tot seconden, wat de bepaling van intrinsieke snelheidsconstanten en de detectie en identificatie van tussenproducten in de reactie ⁴ mogelijk te maken. De hier beschreven procedures kunnen worden toegepast op andere flavine-afhankelijke monooxygenases. ^5,6

Protocol

1. Voorbereiding van Anaërobe Buffer

1. Bereid een L 100 mM kaliumfosfaat buffer pH 7,5. Giet 250 ml van de buffer in een 500 ml-Büchner kolf met een roerstaafje.
2. Sluit de kolf met een rubber stop en plaats deze op een roer plaat. Sluit de korte slang van de kolf van een Schlenk lijn.
3. Ontgas de buffer onder vacuum gedurende 5 uren bij kamertemperatuur roeren. Gedurende deze periode, moet u 5 opeenvolgende rondes van vacuüm ontgassen en spoelen met argon elk uur.
4. Spoel de kolf met argon gedurende 10 seconden en de stekker uit het vacuum spruitstuk. Plaats de kolf in het handschoenenkastje.
5. Laat de kolf open in het handschoenenkastje 's nachts met een heftige bewegingen.

2. Het verwijderen van zuurstof uit de Gestopt-flow-systeem

1. Bereid een L 0,1 M natriumacetaat, pH 5.0. Giet 125 ml van deze buffer in een 250 ml-Büchner kolf en voert u de stappen 1.2-1.4.
2. Weeg 5mg glucose oxidase van Aspergillus niger (181.300 U / g) en 0,9 g glucose met een 1,5 mL Eppendorf buis en 50 ml Falcon buis konische respectievelijk. Plaats beide containers in het handschoenenkastje.
3. Los glucoseoxidase en glucose in 50 ml anaerobe 0,1 M natriumacetaat, pH 5.0 (uiteindelijke concentratie van 18,13 U / ml en 100 mM, respectievelijk). Vul het reservoir spuiten met deze oplossing (figuur 1).
4. Zorg ervoor dat de drive kleppen zijn in de "load"-stand en vul de drive spuiten (figuur 1). Draai de F afsluiter naar de "drive"-stand. Leeg de stop spuit door te klikken op Verwijder in het Pro-Data control software. Druk op de buffer van de aandrijving spuit F door de stroom circuit door handmatig het verhogen van het betreffende station ram. Herhaal stap tien keer in totaal. Voer dezelfde procedure uit met de andere drie rijden spuiten. Wacht een uur.
5. Plaats de oplossing van het reservoir spuiten met dezelfde buffer containing glucoseoxidase en glucose. Herhaal stap 2.4.
6. Herhaal stap 2.5 en laat de oplossing een nacht staan ​​in de stroom-systeem.
7. Na een nacht incubatie, herhaal stap 2.5.

3. Voorbereiding van zuurstof verzadigde Buffer

1. Bereid 100 mM kaliumfosfaat buffer (pH 7,5) en giet 50 ml in een 50 ml flesje met een roerstaaf. Cap de flacon met een Wheaton stop en een Wheaton aluminium verzegeling.
2. Plaats de flacon op ijs. Dompel een lange naald aangesloten op een reservoir met 100% zuurstof in de oplossing. Plaats een andere korte naald door de stop van de flacon als een vent.
3. Bubble de oplossing met 100% zuurstof gedurende 1 uur onder roeren.
4. Verwijder eerst de korte naald uit de flacon en wacht 10 seconden voordat u de lange naald. Plaats de gesloten flacon in het handschoenenkastje.

4. Voorbereiding van NADPH Solution

1. Weeg 1 mg van NADPH in een 1,5 ml Eppendorf buis en plaats it in het handschoenenkastje.
2. Los het NADPH in 300 ul van anaërobe 100 mM kaliumfosfaat buffer pH 7,5. Verwijder 30 pi van deze oplossing uit de handschoenkast de NADPH concentratie te bepalen met een spectrofotometer (ε = _{340 nm} 6270 ^{M-1 cm-1).}

5. Verwijderen van zuurstof uit de enzymoplossing

1. Neem 400 pl van enzym voorraad oplossing uit de vriezer en dooi in het handschoenenkastje. Het enzym stock oplossing (360 uM) werd geprepareerd in 100 mM kaliumfosfaat buffer (pH 7,5) bevattende 100 mM NaCl, en bevroren in vloeibare stikstof.
2. Breng de enzym oplossing in een 25-ml flacon met een roerstaaf, klap op de vuurpijl de flacon met een Wheaton stop en een Wheaton aluminium verzegeling en te verwijderen uit het handschoenenkastje.
3. Plaats de flacon op ijs en sluit deze aan op een Schlenk lijn door het inbrengen van een naald door de stop van de flacon.
4. Ontgas de enzymoplossing door het uitvoeren van 5 opeenvolgende rondenvacuümontgassing en spoelen met argon om de 20 minuten gedurende 1 uur.
5. Spoel de flacon met argon gedurende 10 seconden en de stekker uit het vacuum spruitstuk. Plaats de flacon op het ijs in het handschoenenkastje.

6. Reductieve Half-reactie: Monitoring Flavin Reduction

1. Bereid de gestopte-flow instrument en de Pro-Data control software voor enkele mixing mode volgens het protocol van de fabrikant.
2. Zet een circulerend waterbad (15 ° C). Verwijder zuurstof uit het water door stikstof door het gedurende 20 minuten. Dit voorkomt de zuurstof verontreiniging door de stroming circuit.
3. Handhaaf de temperatuur van de schijf spuiten en waarneming cel bij 15 ° C door aansluiting van de waterbad behuizing van de gestopt-stroom naar de circulerende bad.
4. In het Configuratiescherm van de Pro-Data control software select fotodiode array, externe trigger (in gestopt-flow werking te activeren), en Logarithmic schaal.
5. Start de Pro-Data Viewer software en definieert u de map waar de bestanden worden opgeslagen.
6. Plaats de oplossing van het reservoir spuiten C en F met anaërobe 100 mM kaliumfosfaat buffer (pH 7,5). Draai de C en F kleppen aan de "drive"-stand. Leeg de stop spuit door te klikken op Verwijder in het Pro-Data control software. Druk op de buffer van beide rijden spuiten door de stroom circuit door handmatig het verhogen van het betreffende station ram vijf keer in totaal (op Leeg voor elke beweging van de ram).
7. Om dat glucoseoxidase volledig is verwijderd uit de stroom circuit voeren stap 6.6 vier keer in totaal.
8. Klik op Baseline in de Pro-Data control software.
9. Men mengt 100 pi enzym voorraadoplossing met 1100 pi anaerobe 100 mM kaliumfosfaat buffer (eindconcentratie na het mengen in gestopt stroming van 15 pM).
10. Vervang de oplossing van het reservoir Syringe F met de enzymoplossing. Draai de F afsluiter naar de "drive"-stand. Leeg de stop spuit door te klikken op Verwijder in het Pro-Data control software. Duw het enzym oplossing van rijden spuit F door de stroom circuit door handmatig het verhogen van het betreffende station ram. Voer deze in totaal drie keer. In de Pro-Data control software, stelt de overname tot 60 s.
11. Zorg ervoor dat beide rijden spuiten worden gevuld met de bijbehorende oplossingen en de drive rammen in contact komen met de drive spuit zuigers. Draai de beide kleppen aan de "drive"-stand en klik op verwerven in de Pro-Data control software om het station uit te voeren. Herhaal stap twee keer de gegevens in drievoud verkrijgen. Dit levert spectra van de geoxideerde vorm van het enzym.
12. De _{452 nm} waarde bij de stations bepalen enzymconcentratie voor mengen (ε _{452 nm} = 13.700 ^{M-1 cm-1)} en 4 ml bereiden van NADPH solution 1,5-maal meer geconcentreerd.
13. Vervang de oplossing van het reservoir spuit C met de NADPH oplossing en leeg en vul de halte spuit drie keer, zoals beschreven in 6.10.
14. Herhaal stap 6.11. Dit levert spectra tijdens de reductie van het enzym.

7. Oxidatieve Half-reactie: Monitoring Flavin Oxidatie

1. Bereid de gestopte-flow instrument en de Pro-Data control software voor dubbele mixing mode volgens het protocol van de fabrikant.
2. Herhaal de stappen 6.2-6.5.
3. Plaats de oplossing in de vier reservoir spuiten met anaerobe 100 mM kaliumfosfaat buffer (pH 7,5). Draai de F afsluiter naar de "drive"-positie. Leeg de halte spuit door te klikken op Verwijder in het Pro-Data control software. Druk op de buffer van de drive spuit F door de stroom circuit door handmatig het verhogen van het betreffende station ram. Voer deze stap vijf keer in totaal met elk station spuit.
4. Voer stap 7.3 vier keer in Total volledig te verwijderen van de inhoud van de stroom circuit.
5. Klik Baseline in de Pro-Data control software.
6. Meng 200 pi enzym voorraadoplossing met 1000 pi anaerobe 100 mM kaliumfosfaat buffer (eindconcentratie na het mengen in gestopt stroming van 15 pM).
7. Plaats de oplossing van het reservoir spuit A met de enzymoplossing. Draai de Een klep aan de "drive"-stand. Leeg de stop spuit door te klikken op Verwijder in het Pro-Data control software. Duw het enzym oplossing van rijden spuit A tot en met de stroom circuit door handmatig het verhogen van het betreffende station ram. Voer deze stap drie keer in totaal. In de Pro-Data control software, stelt u de vertragingstijd tot 0,5 s en acquisitie tot 60 s.
8. Zorg ervoor dat alle aandrijving spuiten worden gevuld met de bijbehorende oplossingen en de drive rammen in contact komen met de drive spuit zuigers. Zet alle kleppen aan de "drive" positie en klik verwerven in de Pro-Dateen besturings-softwaremodule naar de schijf uit te voeren. Herhaal stap twee keer de gegevens in drievoud verkrijgen. Dit levert spectra van de geoxideerde vorm van het enzym.
9. Vervang de oplossing van het reservoir spuit B met een NADPH-oplossing 1,5-maal meer geconcentreerd dan de enzym oplossing in spuit A. Draai de B-klep aan de "drive"-stand en leeg en vul de halte spuit drie keer, zoals beschreven in 7.7.
10. Vervang de oplossing van het reservoir spuit C met zuurstofrijk buffer. Draai de C afsluiter naar de "drive"-stand en leeg en vul de halte spuit drie keer, zoals beschreven in 7.7. In de Pro-Data control software, stelt u de vertraging en acquisitietijd op 15 en 900 s, respectievelijk.
11. Herhaal stap 7.8. Dit levert bij de reoxidatie spectra van de volledig gereduceerde enzym.

8. Data-analyse

1. Start de Pro-Data converter software. Klik op het pictogram Opties en selecteer Opslaan in ProDataCSV.
2. Opende map waar de bestanden zijn opgeslagen. Sleep de bestanden naar de EVC-Pro-Data converter venster. De gegevens worden automatisch opgeslagen als CSV-bestanden in dezelfde map.
3. Open het CSV-formaat bestanden met behulp van Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA). Normaliseren de baseline van de gestopte-flow sporen door het aftrekken van de overeenkomstige absorptie bij 700 nm.
4. Analyseer de gecorrigeerde sporen met behulp van KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA) door het aanbrengen van de plot van de absorptie bij de overeenkomstige maximale tegen de tijd om de juiste exponentiële functie. Zoals getoond in figuur 2B, de absorptie bij 452 nm is uitgezet als functie van de tijd om de snelheid van flavine verlaging bepalen na het mengen van de enzym en in het NADPH gestopt-flow instrument. In dit geval is het meest geschikt van de gegevens verkregen met een dubbele exponentiële vergelijking en percentages van 0,65 en 0,23 ^s'1 berekend voor de eerste en tweede fase van de vermindering respectively. Om de snelheid waarmee de C4a-hydroperoxyflavin tussenproduct en de reoxidatie na reactie de verlaagde enzym met zuurstof bepalen werden de gestopt-flow sporen geanalyseerd bij 380 en 452 nm, respectievelijk (Figuur 3B). Met een exponentiële vergelijking wij percentages van 1,4 en 0,006 s ^-1 berekend voor de eerste en tweede stap van de oxidatieve halve reactie, respectievelijk.

9. Representatieve resultaten

De resultaten van de experimenten beschreven in de vorige paragrafen tonen hoe de reductieve halve reactie van een f Sida kan worden gecontroleerd door meting van de veranderingen in de absorptie bij 452 nm, die overeenkomen met de veranderingen in de stand van de redox flavine. De snelheid van deze stap kan worden bepaald door het aanbrengen van de gegevens naar de geschikte vergelijking (figuur 2 stap 8.4). Het verkregen reductie (0,65 ^s'1) is gelijk aan de waarde k _kat berekendsteady-state experimenten ^2, suggereert dat de daling is het snelheidsbepalende stap van de reactie. Gebruikmakend van de dubbele mengen stand van de stopgezette-stroom, kan de snelheid van oxidatie en de tussenproducten in deze halve reactie te bepalen (Figuur 3; stap 8.4). In de reactie gekatalyseerd door A f SIDA, wordt C4a-hydroperoxyflavin duidelijk waargenomen (λ _max 380 nm), en de snelheid van vorming en verval kan worden berekend. Het langzame tempo van de verkregen reoxidatie (0,006 s ^-1) geeft aan dat de C4a-hydroperoxyflavin is zeer stabiel in de afwezigheid van de ornithine.

Schema 1. Mechanisme van een F Sida. De isoallozaxine ring van de FAD cofactor wordt weergegeven. De geoxideerde flavine (A) bindt aan NADPH (B) en reageert onder vorming verlaagd flavine en NADP ⁺ (C). Na reactie met moleculaire zuurstof en binding vanornithine, wordt C4a-hydroperoxyflavin gevormd (D). Dit is de hydroxylering soort. Na hydroxylering van ornithine, moet de hydroxyflavin (E) drogen van de geoxideerde enzyme. NADP ⁺ blijft gebonden in de katalytische cyclus en is het laatste product vrij te geven (F).

Figuur 1. Gestopt-flow instrument. A) Afbeelding van de componenten van de Toegepaste Fotofysica SX20 gestopt-flow spectrofotometer. B) Foto van het monster-unit. C) Regeling van de stroom circuit in dubbele mixing mode.

Figuur 2. Anaërobe reductie van Sida met NADPH in de gestopte-flow instrument. A) Spectrale veranderingen opgenomen na het mengen van gelijke volumes van 30 uM Sida en 45 uM NADPH. De eerste spectrum (geoxideerd SIDA) en laatste spectrum (volledig gereduceerde SidA) is gemarkeerd in blauw en rood, respectievelijk. B) Absorptie spoor bij 452 nm geregistreerd als functie van de tijd.

Figuur 3. Oxidatie van Sida in de gestopte-flow instrument. A) opgenomen Spectrale veranderingen na het mengen van gelijke volumes van de volledig verminderd SIDA en zuurstofrijk buffer. De uiteindelijke concentraties waren 15 uM Sida, 22,5 uM NADPH, en 0,95 mM zuurstof. Het spectrum opgenomen in 0.034, 4.268 en 727.494 en overeenkomt met het volledig gereduceerde enzym, de C4a-hydroperoxyflavin tussenproduct (λ _max 380 nm), en de geoxideerde enzym (λ _max 450 nm), respectievelijk. B) Absorptie spoor op 382 en 452 nm geregistreerd als functie van de tijd.

Discussion

Enzymen die redox-reacties katalyseren bevatten meestal co-factoren, zoals Hemes en flavins die significante absorptie veranderingen ondergaan tijdens de katalytische cyclus. De geoxideerde vorm van het flavine geeft absorptie maxima bij ~ 360 en 450 nm en de reductie wordt typisch gecontroleerd door de absorptie bij 450 nm afname ^7. In het algemeen, een aantal tijdelijke tussenproducten aanwezig zijn, maar vorm en verval te snel moet worden gemeten in de reguliere spectrofotometers. De toegepaste Photophysics SX20 gestopt stroming spectrofotometer (of instrumenten) is het mogelijk te meten absorptie veranderingen in milliseconden tijdschaal (dode tijd, 2 ms). Hier bestudeerden we de reductieve en oxidatieve half-reacties van de flavine-afhankelijke mono-oxygenase A f Sida, die als een model. De snelheid van hydrideoverdracht werd bepaald door meten van de verandering van de absorptie bij 452 nm na het mengen met het enzym NADPH onder anaërobe omstandigheden. Vervolgens waarbij advantage van de dubbele mengen stand van de stopgezette-flow instrument werd het enzym eerst reageren met NADPH, totdat volledige reductie is bereikt, wordt de verminderde enzym-NADP ⁺ complex werd gemengd met zuurstof. Naar aanleiding van deze procedure, is het mogelijk om van voorbijgaande aard zuurstofrijk Flavin tussenproducten op te sporen en om de tarieven van de vorming en verval te meten. De identificatie van deze tussenproducten bevat experimentele gegevens over de aard van de reactie soorten katalyse. Bij A f SIDA, de vorming van de C4a-hydroperoxyflavin (typisch gecontroleerd 370-380 nm), die de hydroxylering soort. Bovendien meten snelheidsconstante van elke stap maakt het mogelijk om over de snelheidsbepalende stap van de reactie te verkrijgen en de kinetische en chemische mechanismen van het enzym te helderen helpen.

In het algemeen kunnen vergelijkbare strategieën worden gebruikt voor andere flavoenzymes of eiwitten die absorptie verandert zich, zoals eiwitten die contain heem, pyridoxal-fosfaat, of niet-heem ijzer ^8-10. Een beperking van deze methode is dat grote hoeveelheden gezuiverd enzym vereist, maar dit kan worden overwonnen door de expressie in hoge opbrengsten. Een bepaalt de optimale eiwitconcentratie voor het opnemen van spectra met behulp van voldoende eiwitten, zodat een sterk signaal kan worden waargenomen, maar niet te veel zelfs dat enzym niet wordt verspild. De laagste enzymconcentratie van flavine-bevattende enzymen in gestopt-flow reactor is 6-10 uM (na menging) en wordt bepaald volgens de bijbehorende molaire extinctiecoëfficiënt van het enzym. Bij A f SIDA, het percentage van het enzym gebonden FAD is 50-65% ^2. Apo-eiwit inactief als in deze experimenten omdat gebonden FAD cofactor nodig voor katalyse. Een andere mogelijke beperking van deze methode is als processen in een enzym dat zich sneller dan 2 ms (dode tijd van de gestopte-flow), zullen ze niet in acht worden genomen, maar eere worden gemeld strategieën waar de tarieven kunnen worden verlaagd om dit probleem te overwinnen. Een voorbeeld van deze omvat met een hoge NaCl concentratie in de reactie van een ferredoxin-NADP ⁺ reductase ^11. Reiniging van zuurstof uit de stroom circuit van de stopgezette-stroom vaak lastig stap in dit experiment en vereist speciale aandacht. De glucose-oxidase-glucose-systeem hier beschreven wordt met succes gebruikt in de meeste laboratoria want het is een effectieve en goedkope methode. Er zijn echter een aantal nadelen die de productie van H ₂ O ₂ omvat en voor sommige toepassingen alternatieven als protocatechuate dioxygenase-protocatechuate moet worden gedacht ^12. Het gebruik van een anaerobe handschoenkast gemakkelijker om anaërobe omstandigheden, maar is niet essentieel. Zuurstof wordt uit de stroom circuit van de stopgezette-flow willen het enzym worden verminderd in afwezigheid van zuurstof of reageren met zuurstof bij concentratiess die we op te geven. Hoewel de gestopte-stroming in het handschoenenkastje, is er zuurstof in de stroom circuit als we aërobe buffers worden gebruikt in de voorgaande experimenten. Naast extinctiemetingen kunnen fluorescentie en circulair dichroïsme assays worden uitgevoerd in Applied Photophysics SX20 gestopt flow spectrofotometer met toebehoren.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
General Laboratory Equipment	Vennootschap	Catalogus nummer
Vacuümpomp	Bedriegen	-
Büchner kolven	Visser	70340-500
Roer bars	Visser	14-512-129
Roer platen	Visser	11-100-49s
Schlenk lijnen	Kontes Glas	-
Argon tank	Airgas	AR UPC300
Stikstof tank	Airgas	NI200
Stikstof tank, ultra hoge zuiverheidsgraad	Airgas	NI UHP200
Zuurstoftank	Airgas	OX 40
5% Waterstof balans stikstoftank	Airgas	X02NI95B200H998
SX20 Stoperator te-flow spectrofotometer	AppliedPhotophysics	-
Handschoenenkastje	Schuchter	-
Waterbad	Brinkmann Lauda	-
Supplies
50 ml BD Falcon buizen	Visser	14-432-23
15 ml Falcon BD conisch	Visser	05-527-90
1,5 ml Eppendorf microcentrifugebuizen	Visser	05-402-18
50 en 25 ml glazen flesjes	Visser	06-402
Rubber stoppers	Visser	06-447H
Aluminium zegels	Visser	06-406-15
Reagents
Kaliumfosfaat, monobasisch	Visser	AC2714080025
Kalium dibasisch	Visser	P288-500
Natriumacetaat	Sigma	S-2889
Glucoseoxidase van A. Niger	Sigma	G7141-250KU
D-glucose	Visser	D16-500
β-NADPH	Visser	ICN10116783
L (+)-Ornithine hydrochloride	Visser	ICN10116783