Fluorescentie-microscopie Screening en next-generation sequencing: Handige hulpmiddelen voor de identificatie van genen betrokken bij organel Integriteit

Samenvatting

Een fundamentele zoektocht in de celbiologie is het definiëren van de mechanismen die de identiteit van de organellen die eukaryotische cellen te maken ten grondslag liggen. Hier stellen we een methode om de genen die verantwoordelijk zijn voor de morfologische en functionele integriteit van plantaardige organellen met behulp van fluorescentie microscopie en next-generation sequencing tools te identificeren.

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een fluorescentie microscoop op basis van screening van Arabidopsis zaailingen en beschrijft hoe in kaart te brengen recessieve mutaties die de subcellulaire distributie van een specifiek gelabeld fluorescente marker in de secretieroute te wijzigen. Arabidopsis is een krachtig biologisch model voor genetisch onderzoek vanwege de grootte van het genoom, generatietijd, en behoud van de moleculaire mechanismen onder de koninkrijken. De array genotypering als een benadering van de mutatie in kaart te brengen alternatief voor de traditionele methode op basis van moleculaire merkers is voordelig omdat het relatief sneller en kunnen aan het in kaart brengen van de verschillende mutanten in een heel kort tijdsbestek. Deze methode maakt het mogelijk de identificatie van eiwitten die de integriteit van de organellen in planten kunnen beïnvloeden. Hier, als voorbeeld, stellen we een scherm om de kaart te genen die belangrijk zijn voor de integriteit van het endoplasmatisch reticulum (ER). Onze aanpak is echter gemakkelijk kan worden uitgebreid tot andere planten celorganellen(Zie bijvoorbeeld ^1,2), en dus een belangrijke stap in de richting van het begrijpen van de moleculaire basis gelden voor andere subcellulaire structuren.

Protocol

1. EMS behandeling

Arabidopsis thaliana zaden worden gemutageniseerd gebruiken is als mutageen middel ethylmethaansulfonaat (EMS) ^3,4, die induceert in het genoom C-to-T-veranderingen als gevolg van C / G op T / A mutaties ^5-7.

1. Weeg 0,8 g Arabidopsis zaden (~ 40.000 zaden) het dragen van de organel fluorescente merker (in het bijzonder, in deze studie ssGFPHDEL (signaalsequentie-GFP-HDEL tetrapeptide) is gebruikt als een ER-marker).
2. Breng de zaden in een 50 ml falcon buis, voeg dan 25 ml gedestilleerd water.
3. Voeg 0,2% (v / v) ethylmethaansulfonaat.
4. Incubeer gedurende ....

Discussie

Hier beschreven een confocale microscopie-screening voor de identificatie van endomembraan mutanten. Deze benadering kan gemakkelijk worden uitgebreid tot andere organellen van de cel die specifieke fluorescente eiwit markers zijn. Het scherm is gebaseerd op de identificatie van mutanten die een afwijkende verdeling van de fluorescerende merker hetzij het doel organel of organellen die niet bedoeld om de marker bevatten vertonen. Respectievelijk deze mutanten vertegenwoordigen populaties die hetzij het vermogen van de o.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer
Ethylmethaan sulfonaat	Sigma	M0880
NaOH	JT Baker	3722-05
Murashige Skoog basismedium w Gamborg vitaminen	Phyto Technolog laboratorie	M404
Phytagel	Sigma	P8169-1Kg
RNeasy mini-kit	Qiagen	74104
Master pure plantaardige blad DNA-zuivering kit	Epicentrum	MPP92100
Bioprime DNA-etikettering	Invitrogen	18094-011
Alcohol 200 proof	Decan Laboratories Inc.	2716
NaOAc	JT Baker
Gen-chip Arabidopsis ATH1genoom-array	Affymetrix	900385
Falcon buis 50 ml	Corning	430290
Eppendorf buizen 1,5 mL
Filter papier 90mm	Whatman papier	1001090
Analytische balans	Mettler Toledo AB54-S	na
Nutating (golf) shaker	Heidolph Polymax 1040	na
Centrifugeer	Eppendorf-R 5417	na