1. Bereiding van de monsters
- Verdun de celsuspensie met ORFLO verdunningsmiddel of een geschikt oplosmiddel, zodat de cel concentratie binnen het bereik van het instrument (3.000 tot 500.000 cellen / ml voor Type M-cassette, of 3.000 tot 2.500.000 cellen / ml voor cassette Type S).
- Een verdunning van 1u05-01u20 (Type M cassette) of geen verwatering tot 1:5 verdunning (Type S cassette) wordt aanbevolen voor de meeste zoogdiercellijnen, maar de aangewezen verdunning is afhankelijk van celtype en zaaien dichtheid. De hoeveelheid vereist een nauwkeurige telling ongeveer 75 pi.
2. Running Monsters
- Zet de Moxi Z op door op de knop en het beginscherm wordt weergegeven.
- Druk op de lade naar beneden en plaats een cassette in de Moxi Z. De Pipetteer 75μL Sample ... het scherm wordt weergegeven.
- Pipetteer een 75 ul monster in de vulopening van de cassette (blauwe ovaallabel 1 of 2, afhankelijk van welk uiteinde van de cassette is geplaatst in het instrument). Deze zijn disposable cassettes die kunnen worden gebruikt 2 tests. Opmerking: Plaats de pipetpunt direct in de laden goed bij ~ 45 ° hoek, zodat de tip wordt gevangen onder de voorste rand van de put. Bij afgifte, is het belangrijk dat het vacuüm niet "vooruit" van de afgifte van de vloeistof als kan leiden luchtbellen de cassette te voeren. Het wordt aanbevolen om een kleine kraal (de grootte van binnenkomst goed) van vloeibare vorm over het wel en hebben tijdens het afgeven.
- Voor het tellen van de meeste cellen van zoogdieren, waar dan ook raak het scherm aan te beginnen. Voor het tellen van zeer kleine deeltjes (4 tot 8 micrometer gemiddelde diameter voor Type M en 3-8 micrometer gemiddelde diameter voor type S), kan de Moxi Z worden uitgevoerd in Small Particle Mode. Opmerking: de cassettes wordt in de zwarte balk boven het scherm. In deze stand Moxi Z stelt de diameter schaal 2 tot 10 urn als standaard en voert de telling uzingen geoptimaliseerde parameters voor de detectie van kleine cellen. Druk op de TOUCH HIER Small Particle Mode knop (zwart vierkant) om de test te starten en uit te voeren in deze modus.
- De Moxi Z begint de test en het aantal cellen resultaten volledig zal zijn in ongeveer 8 seconden (type M cassette) of 15 seconden (Type S cassette).
- De Curve Montage en MVI-berekeningen begint automatisch en vereisen slechts een paar extra seconden. Wanneer een geschikte fit is gevonden, worden de resultaten dan automatisch op het scherm.
- Om Poortsignalen de standaard overname mode te maken, drukt u op de Curve Fit graaf om te schakelen naar Poortsignalen modus.
- Op dit punt de cassette kan worden verwijderd uit het apparaat.
3. Het beheer van gegevens
- Als Automodus scaling is uitgeschakeld, worden de resultaten in eerste instantie weergegeven voor een curve fit rekenen op een diameter schaal van 2-34 micrometer (Type M cassette) of 2-26 μm (Type S cassette). Als Automode schaal is dan de Moxi Z de horizontale as (x-as) automatisch aanpassen aan de gamma die het dichtst bij de breedte van de curve-fit populatie tegelijkertijd alle curve-fit worden weergegeven.
- Als Automodus scaling is uitgeschakeld, om handmatig de resultaten weer te geven met een hogere resolutie, raakt u het 2-26 micrometer pictogram (type M) of de 2-18 micrometer icoon (Type S). Opmerking: De cassette type wordt aangegeven in het blauwe vak in de linkerbovenhoek van het scherm. Dit wordt aanbevolen als tellen kleinere cellen of deeltjes zowel de curve-fitting mogelijkheden als de gebruiker in staat om visueel onderscheid nuances van de gegevens te verbeteren.
- Bij het verhogen van de horizontale resolutie, zal de schaal knop dynamisch aan te passen om te fietsen tussen de beschikbare x-as schaal bereiken: 2-34, 2-26, 2-18, en 2-10 um voor de Type M cassette, of 2 -26, 2-18 en 2-10 urn voor de cassette type S. Deze functie is alleen beschikbaar onmiddellijk na een celgetal.
- Count informatie (cellen / ml) voor de curve-fit gemonteerd of gated regio wordt weergegeven in een zwarte doos onder de linkerkant van het histogram. De gemiddelde celgrootte informatie wordt weergegeven in de zwarte doos onder de rechterkant van het histogram.
- Het MVI-waarde wordt weergegeven een blauw vak in de rechterbovenhoek van het histogram. Als de test is uitgevoerd in kleine deeltjes-modus, is de MVI niet van toepassing en zal worden weergegeven als "MVI = SPM". Ook als de concentratie van cellen buiten het MVI werkbereik, een boodschap van "MVI = Out of Range" wordt weergegeven.
- Om de huidige histogram op te slaan, raakt u de OK icoon. Dit bespaart de gegevens met een naam van "Test XXX" waarbij XXX de desbetreffende test nummer.
- Om handmatig de poort van de histogram, raakt aan de Curve Fit telresultaten knop drukt. Dit maakt Poortsignalen de standaard overname-modus. Schuif vervolgens elke blauwe gating marker om de poorten te stellen of tik op ee links en rechts pijltjes (deze verschijnen op het aanraken van de blauwe gating marker) voor fijn hek aanpassingen Alleen de cellen tussen de markers worden geteld. Het histogram verticale schaal wordt automatisch geschaald op basis van de curve-fit bevolking amplitude. Om deze verticale schaal aan te passen, veegt u het scherm omhoog of omlaag in het histogram regio.
- Raak het Gated graaf resultaten om de display terug te keren naar curve fit-modus en de curve fit-modus de standaard overname mode te maken.
- Druk vervolgens op de OK icoon om de resultaten op te slaan en naar het startscherm terug te keren. Om de resultaten te verwijderen, drukt u op het pictogram Verwijderen op elk gewenst moment definitief te verwijderen van de resultaten van de test.
4. Analyse van Eerder Verworven gegevens
- Om een opgeslagen toets te openen, drukt u op de Histogram icoon op het beginscherm.
- Pictogrammen voor maximaal negen opgeslagen histogrammen wordt weergegeven op het scherm.Druk op de juiste pictogram voor de test van belang of druk op de Page Up of Page Down pictogrammen om meer testresultaten te bekijken.
- Elk histogram zal worden geopend in een van beide de Curve Fit graaf-modus of Gesloten graaf-modus, afhankelijk van hoe het is opgeslagen. In een gesloten Graaf modus kunt gating markers worden geplaatst zoals gewenst door te schuiven elke blauwe gating marker onafhankelijk van elkaar. Auto Gate door het aanraken van de gewenste piek. Tik op om te schakelen tussen de gated graaf en Curve Fit graaf modi.
- Druk op de Zoom en Unzoom pictogrammen om de verticale schaal van het histogram aan te passen. De verticale schaal kan ook worden veranderd door verticaal een vinger op het scherm omhoog (te verhogen) of omlaag (te verlagen).
- Druk op de Delete icoon om definitief te verwijderen van de resultaten van de test.
- Druk op de Done-pictogram omsluit de testresultaten en terug te keren naar het beginscherm. (Opmerking: ingezoomd zicht worden niet opgeslagen.)
5. Gegevens overzetten naar een pc
- De gegevens kunnen worden overgebracht naar een PC met behulp van de Orflo Moxichart applicatie of via een USB-overdracht door het inpluggen van de Moxi Z USB-kabel aan een PC of Mac. Voor de Bluetooth-overdracht (MoxiChart), eerst vast te stellen van het toestel Bluetooth-ID door te drukken op het Bluetooth-pictogram in het beginscherm van de Moxi Z-eenheid.
- Op de computer, opent u de MoxiChart applicatie en klik op Bluetooth-pictogram in de rechter bovenhoek. Kies vervolgens het apparaat dat overeenkomt met de Bluetooth-ID van de Moxi Z en selecteer een doelmap voor de geüploade bestanden.
- Moxichart automatisch de overdracht van alle bestanden naar de opgegeven map via de Bluetooth-verbinding.
- Bestanden die via Bluetooth (MoxiChart) of USB kan worden geopend en analydirect zed met de MoxiChart aanvraag, of, omdat ze zijn opgemaakt. csv-bestanden, kunnen ze direct worden geopend in Microsoft Excel of andere programma's voor gegevensanalyse naar bijkomend / custom analyse.
6. Representatieve resultaten
Om de precisie en nauwkeurigheid van de Moxi Z te beoordelen, tellingen van HEK-293 cellen, HeLa-cellen, CHO-K1, Gist, Jurkat E6-1-cellen, PC12 cellen, en precisie-gekalibreerd kraal suspensies met concentraties variërend van 0-500,000 cellen / ml (type M cassette) en 0-2-2.5e 6 cellen / ml (Type S cassette) werden geteld en vergeleken met een Coulter Z2 en Moxi Z. Alle zoogdiercellen werden verkregen van de American Type Culture Collection (ATCC) en gekweekt zoals eerder beschreven 7-11. In het kort werden cellen gekweekt in suspensie in 75 mm2 weefselkweekflessen met kern media RPMI 1640 (Jurkat E6-1, PC12), MEM (HEK-293, HeLa-cellen) of F12K (CHO-K1) cellen. Alle media werd aangevuld met10% foetaal runderserum en 100 U penicillin/100 pg streptomycine. Kolven werden gehandhaafd in een incubator bij 37 ° C met 5% CO2. Cellen werden elke 3 dagen. Gistcellen (X5, C. albicans, Vin 13) werden geschonken en gebruikt onmiddellijk als voorzien. Uitgangsmonster concentraties ~ 500.000 cellen / ml voor type M cassette gegevens ~ 2 2.5e 6 cellen / ml voor de cassette type S werden vastgesteld met de Coulter Z2. Na de theoretische concentraties werden voorbereid door middel van seriële verdunningen met fysiologische buffers (Isoton II of Balanced Salt Hank's oplossing). Elke concentratie werden gemeten door monsters identiek beide systemen uitgezet tegen elkaar. Zoals blijkt uit fig. 2, er een sterke lineaire correlatie (type M r 2> 0,9886, Type S r 2> 0,9781) tussen de tellingen voor alle monsters. De concentraties werden ook vergeleken met de verwachte / theoretische celconcentraties met zowel de Moxi Z en de Z2 ( Figuur 3) en nogmaals aangetoond sterke lineaire correlaties (Type M r 2> 0,9758, Type S r 2> 0,9774).
Om de precisie te beoordelen, werden HEK-293 en HeLa-cel-tellingen uitgevoerd met behulp van de Coulter Z2, Moxi Z, en een hemocytometer. De gemiddelde variatiecoëfficiënt (CV, n = 19) van het bloedbeeld het gebruik van de Moxi Z (Type M cassette), Coulter Z2 en een hemocytometer werden berekend met CV's gemeten van 5 afzonderlijke tellingen in de 200,000-300,000 cellen / ml bereik. De kleine gemiddelde CV (figuur 4) van de Moxi Z is vergelijkbaar met die van de Z2 en is representatief voor de hoge mate van precisie alleen haalbaar is met Coulter op basis van het tellen van technologieën.
Dimensionering precisie van de Moxi Z instrument werd naast geëvalueerd door het meten van de gekochte, precisie gekalibreerd polystyreen bolletjes. Gemiddelde deeltjesgrootte metingen (n = 5) van Moxi Z werd uitgezet tegen de fabrikant gerapporteerd afmetingen. Zoals in Figuur 5, de Moxi Z metingen consistent afgestemd de fabrikant waarden met een hoge lineaire correlatie (R2 = 0,9989).
Naast omvang en aantal gegevens, Moxi Z biedt een reagens-vrije, algemene beoordeling van de zoogdiercelculturen gezondheid, met het gemelde Moxi Levensvatbaarheid Index (MVI) waarde. Deze index wordt gegenereerd van een verhouding van het aantal cellen in de populatie van belang met betrekking tot het totale deeltjesvormige telt. Om de MVI meetmogelijkheden te tonen, werden MVI lezingen (Type M cassette) in vergelijking met standaard handleiding en flowcytometrische levend / dode meettechnieken. Populaties van dode (<10% haalbaar) HEK-293 en HeLa cellen werden gecreëerd door overnacht incubatie van het levende cellen in een voedingsmedium vrij, natriumfluoride verdunningsmiddel (Isoton II, Beckman) bij 37 ° C. Gecontroleerde theoretische levensvatbaarheid niveaus werden bereid door het mengen van ratiometrically bekende concentraties van levende en dode cellen. Resulting oplossingen werden geanalyseerd voor de levensvatbaarheid van het niveau in twee exemplaren, met zowel hemocytometer telt en flowcytometer metingen. Hemocytometer metingen werden uitgevoerd bij een traditionele 50/50 mengsel van 0,1% Trypan blauwe oplossing en cellen. Flowcytometrie metingen zijn verricht met behulp van een Guava PCA cytometer (Merck) met de Viacount reagens en de door de fabrikant opgegeven protocol (Merck). Zoals getoond in figuur 6, de Pearson correlatiecoëfficiënt waarden (r2) "van de lineaire passing van de MVI gegevens analoge hemocytometer levensvatbaarheid percentages" HEK cellen en HeLa cellen werden r 2 = 0,9937 en r2 = 0,9728, respectievelijk. Deze resultaten tonen aan dat deze aanpak kunst gezondheid informatie geeft over een breed scala aan levensvatbaarheid van de cellen die gunstig vergelijken met de levende / dode metingen verkregen met behulp van een flowcytometer of hemocytometer.
Tabellen en figuren (Van Dittami et al., 2011.) 15:

Figuur 1. Dunne-film Coulter Tellen: Elektrische stroom wordt door de Cel Sensing Zone van de dunne-film cassette. Als cellen stromen enkel bestand door middel van de CSZ, worden de tijdelijke toename van de spanning gemeten door de Moxi Z.

Figuur 2. Moxi Z tellingen vergelijkbaar Coulter Z2 telt. Identieke graven cel kraal suspensies werden geteld met behulp zowel Coulter Z2 en Moxi Z. Gemiddeld aantal waarden (n = 3-4) van de Moxi Z tellingen werden uitgezet ten opzichte van de Coulter overeenkomstige Z2 telt en R2 waarden van de lineaire fit bepaald. A) Type M cassette - concentratiegebied van 0 - 500.000 cellen / ml. B) Type S cassette - concentratiegebied van 0 - 2-2.5e 6 / ml.Error balken geven ± 1 standaarddeviatie.

Figuur 3. Moxi Z concentratiemetingen vs theoretische cel concentraties. A) Type M cassette - Theoretische waarde van de concentratie werden bereid uit seriële verdunningen van een eerste 500.000 cellen / ml monster B) Type S cassette -. Theoretische waarde van de concentratie werden bereid uit seriële verdunningen van een eerste 2 - 2.5e 6 cellen / ml monster. Foutbalken geven ± 1 standaarddeviatie.

Figuur 4. Variatiecoëfficiënt voor de Coulter Z2, Moxi Z (Type M cassette), en hemocytometer. De gemiddelde variatiecoëfficiënt (CV, n = 19) van de HEK-293 en HeLa-cel-tellingen voor elke benadering werden berekend met cv's gemeten van 5 afzonderlijke tellingen van HEK-293 en HeLa cellen in de 200.000 - 300.000 cellen / ml bereik. Foutbalken geven ± 1 standaarddeviatie.

Figuur 5. Precisie van de deeltjesgrootte metingen met behulp van Moxi Moxi Z-Z gemeten kraal grootte (Type M cassette) vs fabrikant gemeld kraal grootte. Foutbalken geven ± 1 standaarddeviatie.

Figuur 6. Cultuur Health Assessment met behulp van MVI - Vergelijking van de MVI-metingen (Type M cassette) en Guava PCA Viacount levensvatbaarheid versus visuele, trypanblauw gekleurd levensvatbaarheid telt met behulp van een hemocytometer.