Het gebruik van eieren van<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Als een<em&gt; In vivo</em&gt; Model van Helminth veroorzaakte longontsteking

Samenvatting

Schistosoma mansoni eieren zijn krachtige stimulatoren van de T-helper type 2 (Th2) immuunrespons, kenmerk van parasitaire infecties, astma en allergische ontsteking. Dit protocol maakt gebruik van S. mansoni ei injectie om een CD4 Th2 cytokine-geïnduceerde ontstekingsreactie in de long, gekenmerkt door long granuloomvorming rond het ei, eosinofilie en macrofaag alternatieve activatie te genereren.

Samenvatting

Schistosoma parasieten zijn bloed staartvinnen die naar schatting 200 miljoen mensen wereldwijd ^een infecteren. In chronische infectie met Schistosoma de ernstige pathologie, zoals leverfibrose en Splenomegalie, wordt veroorzaakt door de immuunreactie tegen het parasieteneitjes dan de parasiet zelf ^2. Parasieteneitjes induceren Th2 respons gekenmerkt door de productie van IL-4, IL-5 en IL-13, de andere activering van macrofagen en de rekrutering van eosinofielen. We beschrijven hier de injectie van Schistosoma mansoni eieren als een model om parasiet-specifieke Th2 cytokine reacties in de longen en de drainerende lymfeklieren, de vorming van pulmonaire granulomen rondom het ei, en luchtwegontsteking te onderzoeken.

Na intraperitoneale sensibilisatie en intraveneuze uitdaging, S. mansoni eieren worden vervoerd naar de longen via de longslagaders waar ze worden gevangen in het longparenchymdoor granulomen samengesteld uit lymfocyten, eosinofielen en alternatief geactiveerde macrofagen ^3-6. In verband met granuloomvorming, ontsteking in de broncho-alveolaire ruimtes, uitbreiding van de drainerende lymfeklieren en CD4 T-cel activatie kan worden waargenomen. Hier hebben we details van het protocol voor het isoleren van Schistosoma mansoni eieren van besmette levers (gemodificeerd uit ^7), sensibiliserende en uitdagend muizen, en het herstellen van de organen (broncho-alveolaire lavage (BAL), long-en drainerende lymfeklieren) voor analyse. We hebben ook vertegenwoordiger van histologische en immunologische gegevens en suggesties voor aanvullende immunologische analyse.

Over het algemeen deze methode zorgt voor een in vivo model om helminth geïnduceerde immunologische responsen te onderzoeken in de longen, dat in grote mate van toepassing zijn op de studie van de Th2-inflammatoire ziekten, waaronder worminfecties, fibrotische ziekten, allergische ontsteking en astma. Voordelen van dit model voor de studie van type 2 ontstekingen in de longen zijn de reproduceerbaarheid van een krachtige Th2 ontstekingsreactie in de long en drainerende lymfeklieren, het gemak van de beoordeling van de ontsteking door histologisch onderzoek van de granulomen rondom het ei, en het potentieel voor lange termijn opslag van de parasiet eieren.

Protocol

1. Zuiverende Schistosoma mansoni eieren

1. Infect Zwitserse muizen met Webster Schistosoma cercariae, de fase van de infectieuze Schistosoma levenscyclus ^8. Als alternatief krijgen schistosoma-geïnfecteerde muizen uit de NIAID Schistosomiasis Resource Center ( http://www.schisto-resource.org/~~V ). Laat muizen 6-7 weken na infectie, waarbij de tijd-punt eieren in de lever en kan teruggewonnen zoals hieronder beschreven worden (zie Fig. 1).
2. Euthanaseren muizen met CO _2, en bevochtig met 70% ethanol. Plaats de muis op de rug. Gebruik stompe tang en schaar weg te snijden huid en de onderliggende buikvlies. Accijnzen de lever, die zich onder de ribbenkast en het middenrif.
3. Fijn gehakt lever en voeg 20 ml per lever digestiemengsel, samengesteld collagenase / Dispase (0,5 mg / ml), penicilline (100 U / ml) en streptomycine (100 pg / ml) in PBS. Zet Mixture in een 50 ml Falcon buis en incubeer overnacht in een 37 ° C shaker.
4. Centrifugeer mengsel bij 400 xg / 3 min / 20 ° C. Giet het overtollige vloeistoffen en vul buis met PBS. Centrifugeer opnieuw en herhaal PBS wassen. Na de laatste centrifugatie, Resuspendeer pellet in 25 ml PBS.
5. Zeef de geresuspendeerde pellet via een standaard keuken metalen zeef (gebruik maken van een 50 ml spuit zuiger om mash de lever stukken door in een glazen beker), gevolgd door het passeren van het mengsel door een fijne zeef (gebruik 10 ml spuit om mengsel duwen door de fijne zeef in een tweede bekerglas).
6. Doe gespannen mengsel in een 50 ml Falcon buis. Centrifugeer op 400 xg / 5 min / 20 ° C. Giet voorzichtig uit bovenstaande vloeistof zonder verlies van pellet. Resuspendeer de cellen in 3 ml PBS.
7. Overlay meng voorzichtig op een 20% Percoll, 40 ml stijgingspercentage van 8 ml en 32 ml Percoll 0,25 M sucrose (FW = 342,3 dus 8,56 g sucrose/100 mL H ₂ 0).
8. Centrifugeer 10 min / 800 xg / 20 ° C. Pipetteer uit eend gooi gelatineuze bovenste laag van de levercellen. Verwijder ei pellet aan de onderkant met een transfer pipet en in een 15 ml Falcon buis.
9. Was de pellet 3X in 10 ml PBS / 1 mM EDTA / 1 mM EGTA met centrifuge instellingen: 3 min / 30 XG / 20 ° C. Resuspenderen in 500 ul PBS.
10. Overlay mix op een nieuwe 25% Percoll, 10 ml gradiënt (2,5 ml Percoll en 7,5 ml 0,25 M sucrose) met behulp centrifuge instellingen: 10 min / 800 xg / 20 ° C.
11. Was 3X in 10 ml PBS met behulp centrifuge instellingen: 3 min / 30 XG / 20 ° C.
12. In de laatste 10 ml wassen, verwijder dan 100 ul om eieren te tellen. Eieren snel af te wikkelen, zodat de Falcon buis moet goed gemengd worden alvorens het verwijderen van monster. Verdun het 100 ul monster met 900 ul PBS. 100 pi van het mengsel te worden beschouwd als druppels op een microscoopglaasje met een stereomicroscoop (1:10). Wide-boring pipetpunten te worden gebruikt.
13. Resuspenderen eieren op 50.000 eieren / ml in PBS. Eieren kunnen worden opgeslagen gedurende een aantal maanden bij -80 ° C en een of TWIC ontdooide voor gebruik. Inspecteer voor gebruik onder een microscoop om ervoor te zorgen dat de eieren nog steeds intact zijn (zie Fig. 1).

2. Intraperitoneale Overgevoeligheid met S. mansoni Eieren: dag 0

1. Bereid eieren 5000 eggs/100 pi PBS in een 5 ml snapcap buis. Voor injectie, schat 50% meer eieren dan nodig is.
2. Laad een 23 gauge ^3/4inch naald en een 1 ml spuit met 100 ul van ei suspensie per muis. Eieren af ​​te wikkelen, zodat belasting naald met eieren onmiddellijk vóór gebruik.
3. Rock spuit heen en weer om eieren te mengen voorafgaand aan elke injectie, en injecteer intraperitoneaal 100 ul van de schorsing per muis.

3. Retro-orbitale Intraveneuze Challenge met S. mansoni Eieren: Dag 14

1. Bereid eieren hierboven op 5.000 eggs/100 pi.
2. Verdoven muizen gespecialiseerde kamer met isofluraan (4%) of intraperitoneaal met xylazine (10 mg / kg) en ketamine (120 mg / kg). Diepte van Anesthesia wordt bepaald door knijpen van de voetzool en het waarborgen van geen fysieke reactie.
3. Na het laden van de 1 ml spuit en 23 gauge ^3/4inch naald met eieren, een tang om de naald te buigen in een hoek van 90 ° met de schuine kant naar beneden in de hoek. Zorg dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.
4. Plaats muis op een kant. Trek de huid, zodat de ogen zal uitsteken, en injecteer 100 ul in de vaten achter de oogbol in een hoek van 45 ° op de neus.
5. Trek de naald en breng lichte druk om het bloeden onder controle.

Al deze procedures worden uitgevoerd zorg en muizen worden gecontroleerd tot ze herstellen anesthesie. Deze protocollen zijn goedgekeurd door de Universiteit van Pennsylvania Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).

4. Experimentele Oogst: Dag 22

1. Euthanaseren muizen met CO _2.
2. Wet muis met 70% ethanol, en de plaats op de rug.
3. Met behulp van stompe Forceps, pakt de muis buik en maak een kleine incisie in de huid. Verwijder voorzichtig de huid met een schaar en bloot de ribbenkast en het buikvlies.
4. Knip het buikvlies. Snijd de abdominale aorta om het bloed te herstellen met een Pasteur pipet. Sla op het ijs.
5. Beweeg de lever naar de membraan bloot. Gebruik fijne schaar om het membraan te snijden. Voorzichtig opengesneden de ribbenkast naar het longweefsel bloot te leggen.
6. Herstel de parathymic lymfeklieren dat de long drain met fijne pincet. Deze worden gestopt onder de ribben aan weerszijden van de thymus ^9. Store op ijs in 1 ml steriele media (DMEM aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal kalfsserum, 100 U / mL penicilline, 100 pg / ml streptomycine, 2 mM L-glutamine, 50 pM 2-mercaptoethanol, alle verkrijgbaar bij Invitrogen).
7. Om de BAL te herstellen, en blaas de longen voor histologische analyse moet intratracheale intubatie worden uitgevoerd. Expose de luchtpijp door het bewegen van de speekselklieren naar de zijkant, en placing fijn pincet onder de luchtpijp. Met behulp van fijne schaar, knipte een gat in het midden van de luchtpijp, en steek slang in de longen. Zet slang door koppelverkoop met chirurgische draad.
8. Bevestig PBS gevulde 1 ml spuit met de slang en pomp longen met 1 ml PBS. Voorzichtig op te halen BAL wassen met een spuit. Sla op het ijs.
9. Bevestig 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS gevulde 1 ml spuit met de slang en blaas de longen.
10. Verwijder de slang en draai de chirurgische draad om te voorkomen dat lekken van de PFA.
11. Voorzichtig ontleden van longweefsel en doe dit in een 50 ml Falcon buis met 5 ml 4% PFA.

5. Voorbereiding van de verkregen weefsels

1. Serum: Na bewaren op ijs gedurende 30 minuten tot 2 uur voor de bloedstolling, serum wordt gewonnen uit het bloed door centrifugeren (13000 xg / 10 min / 4 ° C). Het serum wordt opgeslagen bij -20 ° C en kan worden gebruikt voor cytokine ELISA of S. mansoni eieren antigeen-specifieke IgG-isotype ELISA's ^{6, 10.}
2. Lymfeklieren: enkelvoudige cel suspensies worden bereid en celtellingen gebruikt om de grootte van de immuunrespons te evalueren. Om Th2 cel polarisatie te onderzoeken, worden de cellen opnieuw gestimuleerd met S. mansoni eieren antigeen voor 72 uur. Intracellar cytokine vlekken kunnen worden onderzocht door flowcytometrie en supernatanten kan worden teruggewonnen en opgeslagen bij -20 ° C ELISA van Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) ^6.
3. BAL: Cellen zijn pellets (400 xg / 5 min / 4 ° C). BAS vloeistof wordt teruggewonnen en opgeslagen bij -20 ° C voor de analyse van Th2 cytokinen door ELISA. BAL-cellen telt worden gebruikt als een indicatie voor de luchtwegontsteking. Cytocentrifuge preparaten van 10.000-100.000 cellen (500 toeren / min 5/4 ° C), zal gevolgd door kleuring Diffquik kunnen opsomming van ontstekingsinfiltraat ^{4, 6.} Als alternatief kunnen BAL-cellen worden onderzocht door middel van flowcytometrie ^6.
4. Longweefsel: Lung weefsel is opslaged overnacht bij 4 ° C. Vaste weefsel is in paraffine ingebedde, doorsnede en gemonteerd op dia's voor histologische en immunofluorescentie analyse.

6. Representatieve resultaten

Dit protocol staan ​​alle stappen die nodig zijn om (i) het opstellen gezuiverd Schistosoma mansoni eieren voor in vivo gebruik (afb. 1), (ii) te sensibiliseren en uitdagen muizen met deze eieren en (iii) organen te herstellen voor het onderzoek van de longen ontstekingsreactie. Deze in vivo model drijft reproduceerbaar een krachtige Th2 long inflammatoire respons. Dit blijkt uit de luchtwegen ontsteking en eosinofilie als gevisualiseerd door BAL-cellen en cytocentrifuge preparaten (afb. 2). H & E gebeitst longcoupes kan worden gecontroleerd ei-geïnduceerde granulomen (Fig. 3a) en immunofluorescente kleuring van longcoupes maakt visualisatie van alternatief geactiveerde macrofagen en Th2 cytokinen geïnduceerde genen zoals weerstandstin-achtige molecule (RELM) α (Fig. 3b). De antigeen-specifieke CD4 Th2 cytokine reactie wordt gecontroleerd door ELISA voor IL-5, IL-4 en IL-13 antigeen gestimuleerde parathymic lymfeknoopcellen (Fig. 4).

Figuur 1 Schistosoma mansoni ei injectie model vertegenwoordiger foto's van granulomateuze levers, kenmerk van een hoge S.mansoni-ei-lasten, en van S.mansoni eieren worden getoond -.. Gemiddelde grootte (L) 120 micrometer door (W) 50 um.

Figuur 2. S. mansoni ei injectie rijdt luchtwegontsteking. A. BAL celaantallen (x10 ⁵⁾ van naïeve (N) of S.mansoni (Sm) ei-geïnjecteerde muizen. * P <0.05. B. Cytocentrifuge bereiding van BAL cellen. Mac, macrofagen; Eos, eosinofielen, lymfe, lymfocyten. Bar, 10 pm.

Figuur 3. Visualisatie van pulmonaire granulomen en als alternatief geactiveerde macrofagen rondom het S.mansoni ei. A. Pulmonale granuloom rond de Sm ei (zwarte pijl) werd gevisualiseerd in H & E-gekleurde long secties. B. immunofluorescentiekleuring voor RELMα (groen), mannose receptor (rood) en DAPI (blauw) blijkt alternatief geactiveerde macrofagen (witte pijl) in het granuloom rond de autofluorescente Sm ei (zwarte pijl). Bar, 50 pm.

Figuur 4. S.mansoni ei antigeenspecifieke Th2 cytokinereactie. Afvoeren parathymic lymfeknoopcellen van naïeve (N) of Sm ei-geïnjecteerde muizen werden gestimuleerd met Sm </ Em> ei antigeen 72 uur, gevolgd door ELISA van supernatanten van IL-4, IL-5 en IL-13. Schaal, ng / ml. * P <0,05.

Discussie

Hier wordt een model in dienst Schistosoma mansoni eieren van type 2 longontsteking veroorzaken beschreven. Kenmerken van dit model zijn de krachtige Th2 immuunrespons, ontsteking van de luchtwegen en longen granuloomvorming. Aangezien deze parameters afhankelijk van CD4 Th2 celreacties ¹¹ is een nuttig model om de effecten van eiwit-specifieke of lijn-specifieke deleties op Th2 cel respons. Hier is de uitlezingen zou omvatten kwantificering van antigeen-specifieke Th2 cytokines, een analyse van de c...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagens	Grootte / Beschrijving	Vennootschap	Catalog #
Collagenase / Dispase	500 mg	Roche Applied Science	11 097 113 001
Diff Quik Hema 3 Stain	Verpakken	Fisher Scientific Co LLC	122-911
DMEM	Vloeistof	Gibco	11965
Falcon 50 ml	Verpakken	Valk	352070
Intramedic PE slang	0,58 mm	Becton Dickinson & Co	427410
Isofluraan	250 ml	Abt Animal Health	52600405
Ketamine	100 mg / mL	Fort Dodge Animal Health	N / A
Mannose receptor antilichaam	Biotine	Abd Serotec	MCA2235B
Metallic Zeef	Standaard keuken zeef	Doel	Laurentiis
Paraformaldehyde	16%	Electron Microsc. Wetenschappen	15710
Penicilline / streptomycine	100x	Gibco	15070
Percoll	1 Liter	GE Healthcare Biosciences	17 0891 01
RELMα antilichaam	50 ug	Peprotech	500-P214
Chirurgische bericht	2,0 USP 100 yds	Chirurgische Specialties Corp	SP118
Naald	23g, 3/4 inch	BD Vacutainer Lab. Med.	305143
USA Standard Testing Zeef	150 pm, 0,0059 "	WS Tyler, Inc	ASTME-11, Spec. Nr. 100
Xylazine	20 mg / ml	Butler	N / A